Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in Xenopus tropicalis
25 mei 2017
Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is om de vaatstructuur van Xenopus tropicalis kikkervisjes te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cardiovasculaire biologie, zoals hoe angiogenese wordt gereguleerd. Het grote voordeel van deze techniek is dat bloedvaten in een intact embryo van het juiste type kunnen worden gevisualiseerd door een eenvoudige injectie van een fluorescerende kleurstof.
Begin door een micro loader te gebruiken om een taps toelopende glasmicropipet te vullen met ongeveer vijf microliter heldere diI geacetyleerde LDL-oplossing, zorg ervoor dat er geen geprecipiteerde deeltjes worden geladen. Gebruik onder een dissectiescoop een fijn nummer 55 tang om de punt van de pipet af te knippen om het volume van het geladen complex aan te passen en stel het onder druk gecontroleerde injectiesysteem in om ongeveer vijf nanoliter oplossing per injectie uit te stoten. Dompel vervolgens de punt van de pipet in 0,04% MS-222 in 0,1X gemodificeerd Barth's-zoutoplossing of MBS in een op maat gemaakte Sylgard-vorm.
Breng vervolgens het Xenopus tropicalis-embryo over naar de Sylgard-vorm en bevestig volledige sedatie met een gebrek aan reactie op stimulatie van de rugvin. Laad onder de dissectiescoop het embryo met de buikzijde naar boven in de V-vormige inkeping van de mal in een licht schuine positie. Plaats twee 0,1 millimeter minutian-spelden strak in een speldenhouder en gebruik een speld om de huid boven het hart te doorboren, dat zichtbaar moet pulseren.
Breng de speld door het gat in de ruimte tussen het hart en de huid zonder het hart te doorboren en plaats de ingebrachte punt binnen het gebied waar de incisie zal worden gemaakt. Wrijf vervolgens de tweede speld tegen de ingebrachte speld om een lijnvormige incisie te maken en gebruik beide spelden om de incisie voorzichtig te verbreden, waarbij het hart wordt blootgesteld. Om de DiI geacetyleerde LDL-oplossing te injecteren, steekt u de glaspipetpunt in het hart en injecteert u 50 tot 60 nanoliter van de DiI geacetyleerde LDL in ongeveer 10 uitwerppulsen.
Wanneer alle kleurstofoplossing is afgegeven, bevestigt u dat het hart nog steeds klopt en brengt u het embryo over in een nieuwe petrischaal met 0,1X MBS. Na vijf tot tien minuten zou de kikkervis zich moeten herstellen van de anesthesie en beginnen te bewegen. Nadat een geschikt aantal embryo's is geïnjecteerd, screent u de correct gelabelde geanesthetiseerde embryo's visueel onder een fluorescentiemicroscoop en gooit u alle dieren weg die andere organen hebben gelabeld.
Embryo's die onvoldoende zijn gelabeld, kunnen opnieuw worden geïnjecteerd. Vang vervolgens afbeeldingen van de correct gelabelde embryo's. Voor een grondiger beeldvorming van de bloedvaten, fixeert u de opnieuw geanesthetiseerde embryo's in 4% paraformaldehyde gedurende een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht voor visualisatie door confocale microscopie.
Als er voldoende diI geacetyleerde LDL in het hart wordt geïnjecteerd, zou de achterste cardinale ader, of PCV, onmiddellijk zichtbaar moeten zijn onder een fluorescentiemicroscoop. De intersomitische aders, of ISV's, komen dorsaal uit de PCV in een golf van voor naar achter beginnend in stadium 36 en eindigend rond stadium 40 tot 41 en worden licht vertakt rond stadium 43. De PCV en ISV's groeien in een stereotiepe angiogene patroon dat onder strikte ontwikkelingscontrole staat.
Interessant is dat de knockdown van TIE-2-signalering door antisense morphalinos de lengte en de complexiteit van de ISV's vermindert, terwijl expressie van de constitutief actieve vorm van TIE-2 overmatige ISV-vertakking induceert. Een Vein Complexiteit Index kan worden berekend om de complexiteit van de ISV's te beoordelen en weergegeven paden kunnen worden gegenereerd om de algehele architectuur van de embryonale Xenopus tropicalis-vaatstructuur te visualiseren. Het oorspronkelijke protocol werd beschreven voor gebruik van Xenopus laevis door Levin en Colics en we hebben het aangepast voor Xenopus tropicalis.
Eenmaal beheerst kan deze techniek in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Voor deze procedure kunnen genetische en farmacologische manipulaties worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke genen en signaalroutes de vasculaire ontwikkeling reguleren. Met behulp van deze procedure kan de gelabelde vaatstructuur in een intact dier in realtime worden geïmageeerd, wat een krachtig hulpmiddel biedt voor het onderzoeken van de dynamica van vasculaire ontwikkeling.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe diI geacetyleerde LDL in het hart van een Xenopus tropicalis-kikkervisje moet worden geïnjecteerd om de vaatstructuur te visualiseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert een fluorescentiegebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis. De techniek maakt beeldvorming van bloedvaten mogelijk kort na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het hart van het embryo, wat studies naar de cardiovasculaire ontwikkeling in vivo faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cardiovasculaire biologie
- Angiogenese
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Xenopus tropicalis is een modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van gewervelden.
- Inzicht in de vasculaire ontwikkeling is essentieel voor het begrijpen van diverse ziekten.
- Fluorescentie-beeldvormingstechnieken verbeteren de visualisatie van biologische structuren.
- Deze methode maakt real-time observatie van vasculaire veranderingen mogelijk.
Doel van de studie
- Om de vasculatuur van Xenopus tropicalis kikkervisjes te visualiseren.
- Om de regulatie van angiogenese te onderzoeken.
- Om een eenvoudige en effectieve methode te bieden voor het bestuderen van de cardiovasculaire ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Injectie van een fluorescerende kleurstof in het hart van het embryo.
- Gebruik van een micro-loader en een taps toelopende glazen micropipet voor nauwkeurige toediening van de kleurstof.
- Visualisatie van bloedvaten onder een dissectiemicroscoop.
- Toepassing van genetische en farmacologische manipulaties om effecten op de vasculatuur te bestuderen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisatie van bloedvaten in intacte embryo's.
- Kwantificering van de vasculaire complexiteit gerealiseerd via beeldvorming.
- Verworven inzichten in de dynamiek van de cardiovasculaire ontwikkeling.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode voor injectie van fluorescerende kleurstof.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling.
- Fluorescente beeldvorming is een krachtig instrument voor real-time analyse.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar cardiovasculaire biologie faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze methode maakt directe visualisatie en kwantificering van vasculaire complexiteit in een gewervde modelorganisme mogelijk, wat vroege targetvalidatie in angiogenese-routes ondersteunt. Door kwantitatieve resultaten van vaatuitloping en vertakking te bieden, faciliteert het de mechanistische risicoreductie van vasculaire targets voordat er wordt overgegaan tot lead-identificatiecampagnes. Het Xenopus tropicalis-systeem biedt een ziekte-relevant platform voor het beoordelen van angiogene fenotypes met voorspellende betrouwbaarheid in preklinisch cardiovasculair onderzoek.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen over angiogene regulatoren, zoals TIE-2-signalering, mogelijk door directe observatie van vaatuitlopingspatronen.
- Operationele waarde: Biedt een snelle workflow van één week om de impact van genen of signaalpaden op de vasculaire ontwikkeling te beoordelen zonder dat genetisch gemanipuleerde modellen vereist zijn.
- Voorspellende waarde: Kwantificeerbare resultaten, zoals de Vein Complexity Index, ondersteunen een objectieve beoordeling van de effecten van targetmodulatie voor beslissingen over portfoliotriage.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare vasculaire labeling die compatibel is met downstream imaging- en analysepipelines.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van de lengte van de intersomitische aderen en de vertakkingscomplexiteit mogelijk als dosisresponsieve read-outs voor compound screening.
- Schaalbaarheid: Een eenvoudige procedure voor kleurstofinjectie en imaging ondersteunt medium-throughput evaluatie van farmacologische of genetische perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert stereotype angiogenese in Xenopus tropicalis, wat inzicht biedt in menselijke vasculaire ontwikkelingspaden.
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie via geconserveerde angiogene mechanismen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt snelle tests van padmodulatoren mogelijk om de doelbiologie te verduidelijken voordat er wordt geïnvesteerd in studies met zoogdiermodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetesten voor targets tot leadidentificatie en levert vasculaire fenotypegegevens die de go/no-go-beslissingen in programma's gericht op angiogenese onderbouwen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door genetische of farmacologische verstoringen te koppelen aan kwantificeerbare veranderingen in de vasculaire architectuur.
- Screening: Levert reproduceerbare, op beeldvorming gebaseerde read-outs die geschikt zijn voor het evalueren van de effecten van verbindingen op angiogene uitlopers.
- Analytica: Biedt kwantitatieve metrieken voor vasculaire complexiteit die objectieve vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van geconserveerde angiogenesemechanismen om continuïteit te waarborgen van embryonale modellen naar vasculaire systemen van zoogdieren.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor vasculaire fenotypering dat toepasbaar is op meerdere projecten gericht op angiogenese.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van angiogene targets door middel van directe, kwantitatieve visualisatie van vasculaire netwerken.
- Operationele waarde: Standardiseert de vasculaire beoordeling via eenvoudige kleurstofinjectie en reproduceerbare beeldvorming, waardoor de variabiliteit tussen experimenten wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van vasculaire targets mogelijk te maken, wat het risico op falen in een laat stadium van cardiovasculaire programma's verkleint.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van angiogenesis-modifiers op basis van kwantitatieve fenotypische resultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken voor de hantering van embryo's en cardiale micro-injectie.
- Afhankelijk van de infrastructuur voor fluorescentiemicroscopie voor de visualisatie van vaten en beeldvastlegging.
- Vereist standaardisatie van de embryonale stadia en het tijdstip van injectie voor een consistente vasculaire labeling.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij het uitbreiden van de bevindingen naar andere modelsystemen of contexten van menselijke relevantie.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de toegankelijkheid van embryo's en de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van de kleurstofconcentratie om aspecifieke labeling te voorkomen.
