Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis

Het algemene doel van deze procedure is om live-imaging en eenvoudige kwantificeringsmethoden te demonstreren voor de analyse van de morfologie van embryonale epitheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst alle benodigdheden en apparatuur klaar te zetten. De tweede stap van de procedure is het excideren van X-explantaten uit kikkerembryo's en deze te plaatsen in kamers voor langetermijncultuur.

De derde stap van de procedure is het in real-time verzamelen van beelden met een hoge resolutie van epitheliale cellen. De laatste stap van de procedure is het kwantificeren van morfologische details van epitheliale cellen met behulp van Image J. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via confocale microscopie met een hoge resolutie gevolgde celgebieden en membraanintensiteiten laten zien. Hallo, ik ben Sagar Joshi van het Davidson Laboratory van de afdeling Bioengineering aan de University of Pittsburgh.

Vandaag tonen we u een procedure voor live-cell imaging en kwantitatieve analyse van embryonale epitheelcellen van Xenos lavia. We gebruiken deze procedure om veranderingen in het celcytoskelet in realtime te bestuderen. Laten we beginnen.

Om kamers voor te bereiden voor het kweken van animal cap caps, gebruikt u siliconenvet om een op maat gemaakte acrylkamer of een kleine nylon ring op een groot dekglas van 45 bij 50 millimeter af te dichten. Voeg één milliliter 1%BSA in één derde XMBS toe aan de kamer. Coat kleine fragmenten dekglas met dezelfde oplossing en incubeer deze gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur of overnight bij vier graden Celsius.

Om de adhesie van het X-explant aan het glas te verminderen, spoelt u de kamer en vult u deze met DFA-medium; vlak voordat de xs worden overgebracht, spoelt u de coverslipfragmenten op dezelfde wijze. Dompel ze vervolgens onder in een schaal met DFA-kweekembryo's die in hetstadium van één tot vier cellen zijn gemicro-injecteerd met het gewenste MR NA tot het gewenste stadium in een derde XMBS. Gebruik een transferpipet met een schuine opening om de embryo's onder een dissectiestereomicroscoop over te brengen naar een schaal met DFA.

Gebruik een pincet om de embryo's te prepareren voor het excideren van een animal cap. Gebruik een haarlus om een embryo in één positie te ondersteunen. Gebruik een haarmesje om een kleine incisie in de animale pool te maken.

Maak herhaaldelijk korte, soepele snijbewegingen om de incisie te verlengen en het ectoderm van de kap te verwijderen. Exciteer op dezelfde wijze drie of vier x explanen. Gebruik vervolgens een transferpipet om deze naar de voorbereide kweekkamer te verplaatsen.

Plaats elke X explan met behulp van de haarlus zodanig dat het epitheel naar de bodem van de kamer is gericht. Houd met een pincet een fragment van een dekglas bij het midden vast.

Doop de uiteinden in siliconenvet. Plaats één fragment over elke X explan. Fixeer elk fragment voorzichtig op zijn plaats met kleine hoeveelheden siliconenvet.

Zorg ervoor dat de X explan niet volledig wordt verbrijzeld door overmatige kracht. Vul de kamer met DFA en bestrijk de bovenranden van de kamer met siliconenvet. Sluit de bovenkant vervolgens af met een dekglas van 24 x 40 millimeter.

Pas het niveau van de DFA in de kamer aan om luchtbellen te verminderen en gebruik weefsel om eventuele overloop weg te blotten. De X-planten kunnen nu langdurig in de verzegelde kamer worden gekweekt gedurende een dag bij kamertemperatuur; breng vervolgens het 20 x objectief van een confocale microscoop in positie. Plaats de kamer met de X-explan op de objecttafel van de microscoop en leg kleine balanceergewichten op de kamer om deze onder helderveldverlichting op zijn plaats te houden.

Stel de focus in en gebruik de grove positionering om de apicale uiteinden van de oppervlakkige cellen te visualiseren. Schakel over naar fluorescentie en een objectief met een hogere vergroting. Om enkelvoudige beelden of time-lapse video's van het geëxplaneerde epitheel op te nemen, dient de acquisitie te worden afgesteld om het best mogelijke beeld te verkrijgen.

Raadpleeg het geschreven gedeelte van dit protocol voor tips over het afstellen en het maken van beelden. Houd het laservermogen zo laag mogelijk. Leg beelden of time-lapse-films vast van het x explan epithelium.

Raadpleeg het geschreven gedeelte van het protocol voor suggesties over gegevensverzameling. Confocale afbeeldingsbestanden kunnen op verschillende manieren worden geanalyseerd om gegevens te extraheren. Hier volgen twee voorbeelden van hoe gegevensbestanden kunnen worden geanalyseerd met behulp van de Image J-analysesoftware met de Bio-Formats plug-in.

Om het celoppervlak van een epitheelcel te meten, opent u het analysemenu en klikt u op meetinstellingen. Selecteer het selectiehulpmiddel uit de werkbalk en omtrek de cel; selecteer vervolgens in het analysemenu hulpmiddelen en daarna ROI-manager. Om de beheerder van regio's van interesse te openen, drukt u op control t.

Om de omtrek aan de ROI-manager toe te voegen, selecteert u zoveel mogelijke omtrekken uit de afbeelding als gewenst en voegt u deze toe. Klik vervolgens op save om de ROI-set op te slaan in de ROI-manager. Klik op measure.

Het resultatenvenster toont nu de gemeten oppervlakten van elke ROI. Om de intensiteit van een celmembraan te meten, selecteert u de tool voor rechte lijnen uit de ImageJ-werkbalk. Trek een loodrechte lijn door het membraan.

Druk op CTRL T, zoals in het vorige voorbeeld. Om de selectie aan de ROI-manager toe te voegen, opent u het analysemenu en klikt u op 'plot profile' om een plot van de relatieve intensiteiten over de lijn te genereren. Om de grafiek als afbeelding op te slaan, klikt u op 'save' in het nieuwe plotvenster dat verschijnt.

Open het lijstmenu naar bestand en selecteer 'opslaan als'. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u embryonale epitheelcellen uit een weggesneden dierlijke CapEx-explantaat in vivo kunt afbeelden en kwantificeren. Tijdens deze procedure is het belangrijk om antibioticum en antibioticum aan het DFA toe te voegen. Om bacteriële en schimmelgroei te voorkomen, dient u extra voorzichtig te zijn bij het platdrukken van explantaten onder de dekglasplaatjes, omdat een te hoge druk het explantaat kan beschadigen.

Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat de instellingen van de confocale microscoop optimaal moeten zijn om beeldgegevens van maximale kwaliteit te verkrijgen. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.