Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties
31 juli 2017
Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.
Het algemene doel van dit protocol is om kwantitief de componenten van de tumormicro-omgeving in glioblastoompatiëntenresecties te identificeren met behulp van chromogene immunohistochemie en Image J.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de tumormicro-omgeving, zoals hoe deze componenten eruitzien in patiëntenmonsters en hoe we fysiologisch relevante verhoudingen van cellen kunnen bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig is voor analyse in patiëntenmonsters. De implicaties van deze techniek reiken tot het verduidelijken van de onvoldoende gekarakteriseerde, complexe glioblastoomtumormicro-omgeving.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het timing voor chromogene ontwikkeling nauwgezet gecontroleerd moet worden om overontwikkeling en verzadiging van het weefsel te voorkomen. Begin het protocol door de wasbeurten uit te voeren die in de bijbehorende tekstprotocol zijn gespecificeerd. Verdun de tris-gebaseerde hoge pH antigeenontmaskeringsoplossing en gedistilleerd water met behulp van de aanbevelingen van de fabrikant.
Ga verder met warmte-gemedieerd antigeenherstel door de verdunde ontmaskeringsoplossing toe te voegen aan een niet-verzegelde magnetronbare container. Plaats de slides in de container. Plaats vervolgens de container met de slides in de magnetron.
Kook vervolgens de container gedurende 20 minuten op hoog vermogen. Controleer het vloeistofniveau op verdamping en vul de container indien nodig aan met gedistilleerd water. Laat de monsters een uur afkoelen in de oplossing op kamertemperatuur.
Omlijn het weefselmonster met een hydrofoob om het volume aan reagentia dat nodig is om het monster te bedekken, te minimaliseren. Pipeer vervolgens voldoende permeabiliseringsoplossing, 100 tot 200 microliter, om het weefselmonster te bedekken. Verwijder en gooi de oplossing weg en bedek het weefselmonster opnieuw met permeabiliseringsoplossing.
Incubeer de monsters op kamertemperatuur met blokkeringsoplossing gedurende een uur. Incubeer vervolgens de monsters een nacht op vier graden Celsius met primaire antilichamen verdund in blokkeringsoplossing. De volgende dag detecteert u primaire antilichamen met behulp van een paardenradishperoxidasepolymeerreagens dat overeenkomt met het gastheerdier van het primaire antilichaam.
Pipeer voldoende permeabiliseringsoplossing om het weefselmonster te bedekken en incubeer het monster gedurende vijf minuten. Verwijder en gooi de oplossing weg en bedek het weefselmonster nog een keer gedurende vijf minuten met permeabiliseringsoplossing. Incubeer de slides in 0,3% waterstofperoxide en IX TBS gedurende 15 minuten.
Ontwikkel de monsters met een peroxidase diaminobenzidine of dab substraat gedurende twee tot 10 minuten totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt. Tegenkleuren de monsters om celkernen te identificeren, zoals met hematoxylinen volgens het protocol van de fabrikant. Dehydrateer monsters met 100% ethanol en xyleen.
Monteer ten slotte de monsters permanent met montagemedium. Twee interessegebieden binnen onze tumorresecties, de primaire tumor Bulk en de aangrenzende gebieden, voornamelijk bestaande uit gezond weefsel met verspreide invasieve kankercellen, werden geïdentificeerd door een samenwerkende neuropatholoog op hematoxylinen en eosine gekleurde patiëntenmonsters. Chromogene immunohistochemie identificeerde positieve kleuring voor astrocyten, microglia en oligodendrocyten binnen elk patiëntenmonster.
We voerden kleuring uit zonder primair antilichaam voor een negatieve controle. De door de fabrikant aanbevolen en verdere verdunningen voordat we op de een op 200 verdunning kwamen vanwege optimale positieve kleuring van de cellichaam en het proces met minimalisering van de achtergrond voor het anti ALDH 1l1 antilichaam. Met behulp van Image J werd de percentage dekking van OSP-1 positieve oligodendrocytenkleuring gekwantificeerd om uiteindelijk verschillen in onze interessegebieden te vergelijken.
Zodra de juiste drempelwaarde op de afbeelding is toegepast, kan de percentage dekking vanaf de drempelwaarde worden gemeten en vergeleken voor meerdere patiënten. Vijf aangrenzende en bulkgebieden van glioblastoom of GBM patiëntenmonsters, samen met gezond hersenweefsel, werden vergeleken op oligodendrocyt-specifiek eiwit één of OSP1 percentage dekking. Zodra de kleuringstechniek is beheerst, kan de kleuringstechniek in vier uur op de eerste dag en twee uur op de tweede dag worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de intensiteit van de weefselkleuring en hydratatie nauwgezet te controleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de kwantitatieve identificatie van componenten van de tumormicro-omgeving in resecties van glioblastoompatiëntenen met behulp van chromogene immunohistochemie en ImageJ. Deze techniek is erop gericht inzicht te verschaffen in de complexe tumormicro-omgeving van het glioblastoom.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Histologie
Achtergrond
- Glioblastoom is een zeer agressieve hersentumor.
- De tumormicro-omgeving speelt een cruciale rol bij de progressie van de tumor.
- Inzicht in de samenstelling van deze omgeving is essentieel voor de ontwikkeling van gerichte therapieën.
- Chromogene immunohistochemie maakt gedetailleerde visualisatie van weefselcomponenten mogelijk.
Doel van de studie
- Om de tumormicro-omgeving in glioblastoommonsters kwantitatief te beoordelen.
- Om fysiologisch relevante ratio's van verschillende celtypen te bepalen.
- Om een eenvoudige analysemethode voor patiëntenmonsters te bieden.
Gebruikte methoden
- Chromogene immunohistochemie voor weefselkleuring.
- ImageJ-software voor kwantitatieve analyse.
- Protocollen voor het wassen en het onmaskeren van antigenen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Zorgvuldige monitoring van de timing van de chromogene ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van diverse componenten van de tumormicro-omgeving.
- Vaststelling van methoden voor het bepalen van celratio's in glioblastoommonsters.
- Inzichten in de complexiteit van de glioblastoommicro-omgeving.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op patiëntenmonsters.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van glioblastoom-microomgevingen.
- Het helpt bij het begrijpen van de interacties binnen de tumormicroomgeving.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om behandelstrategieën voor glioblastoom te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve analyse van de tumormicro-omgeving in patiëntafgeleide glioblastoommonsters maakt mechanistische risicoreductie van gliale celdoelen bij de ontdekking van geneesmiddelen voor neuro-oncologie mogelijk. Door reproduceerbare, regio-specifieke metingen van astrocyten, microglia en oligodendrocyten te leveren, ondersteunt deze methode doelvalidatie en fenotypische screening in ziekte-relevante systemen. Het vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door de samenstelling van de micro-omgeving te koppelen aan therapeutische respons en resistentiemechanismen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om gliale celphenotypen en hun functionele toestanden binnen heterogene tumorregio's te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, op beelden gebaseerde readouts voor het beoordelen van target engagement en modulatie van de micro-omgeving.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biomarker-gestuurde targetselectie door de abundantie van glia te correleren met pathologische gradiënten in patiëntenmonsters.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Stelt gestandaardiseerde immunohistochemische protocollen vast die compatibel zijn met high-throughput imaging- en analysepijplijnen.
- Kwantitatieve output: Levert metrieken voor het percentage dekking via ImageJ die vergelijkingen tussen monsters en tussen regio's mogelijk maken.
- Reproduceerbaarheid: Definieert kritische timingcontroles voor chromogene ontwikkeling om signaalspecificiteit te waarborgen en achtergrondruis te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Maakt gebruik van daadwerkelijke resectie-monsters van patiënten om de pathofysiologische getrouwheid in targetvalidatiestudies te behouden.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen door kwantitatieve benchmarks te definiëren voor de samenstelling van gliacellen.
- Risicobeperking: Vermindert onzekerheid bij biologische risicoanalyse voor gliagerichte therapieën door de micro-omgevingscontext te karakteriseren.
Integratie van pijplijn en workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor neuro-oncologische programma's die gericht zijn op de modulatie van de micro-omgeving.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door ruimtelijke en kwantitatieve profilering van gliapopulaties in menselijk weefsel mogelijk te maken.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare kleuringspatronen die kunnen worden gebruikt om de effecten van verbindingen op de samenstelling van de micro-omgeving te evalueren.
- Analytics: Biedt drempelwaarde-gebaseerde metingen van het percentage dekking, waardoor statistische vergelijking tussen experimentele condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij biomarkerstrategieën door gliaceldichtheden te koppelen aan histopathologische regio's van belang.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een overdraagbare IHC/ImageJ-workflow die toepasbaar is op glioom en andere CNS-tumormodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste analyse van gliacellen in patiëntmonsters.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor antigeen-retrieval, blokkeren en ontwikkelingstijden.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door ambiguïteit in interacties binnen de micro-omgeving van het target te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van glia-modulerende therapeutica mogelijk op basis van gegevens over de betrokkenheid van de micro-omgeving.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunohistochemie en de verwerking van neuropathologische monsters.
- Afhankelijk van een geoptimaliseerde timing van de chromogene ontwikkeling om verzadiging van het signaal te voorkomen.
- Vereist gestandaardiseerde ImageJ-thresholdingprotocollen voor een consistente kwantificering.
- Vereist toegang tot resectiemonsters van glioblastoom afkomstig van patiënten met geannoteerde regio's van belang.
- Beperkt door weefsheterogeniteit en de noodzaak van regio-specifieke analyse om verwarrende signalen te vermijden.
