Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

Het algemene doel van deze procedure is om goede coronale secties van de hypofyse te verkrijgen met goed bewaarde weefselstructuren van zich ontwikkelende muizen. Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hypofysontwikkeling, zoals hypofysehistologie, celdifferentiatie, proliferatie en apoptose. Het grote voordeel van deze techniek is dat zich ontwikkelende muishypofysen kunnen worden gedissecteerd zonder zichtbare schade en correct worden georiënteerd om coronale secties te bereiken.

We kregen het idee voor deze methode toen we ontdekten dat het voor zich ontwikkelende muishypofysen technisch moeilijk was om goede coronale secties te verkrijgen. Na het anestheseren en fixeren van muizen volgens het tekstprotocol, gebruikt u schaar om het schedelbot open te snijden. Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig de achterhersenen vanaf de basis van de schedel op te tillen.

Bij het eerste teken van de sella turcica, stop met tillen maar houd de achterhersenen vast en gebruik een fijne schaar om de hypofysesteel en zenuwvezels verbonden met de hersenbasis door te snijden. Blijf de hele hersenen optillen en verwijderen om de hypofyse volledig bloot te leggen. De hypofyse rust op het dorsale oppervlak van het sfenoïde bot en wordt lateraal omringd door trigeminuszenuwen.

Gebruik vervolgens schaar om het gehele sellaire gebied, inclusief de hypofyse, laterale trigeminuszenuwen en onder het sfenoïde bot, door te snijden. Plaats het weefsel in een 35 mm schaal met 4% PFA en incubeer het bij 4 graden Celsius gedurende 40 minuten tot 3 uur, afhankelijk van de leeftijden. Was vervolgens het gefixeerde weefsel met 10 mL PBS gedurende vijf verversingen van 15 minuten elk.

Breng het gefixeerde weefsel over in een 35 mm schaal met 1 mL PBS en onder een stereomicroscoop dissocieert u de hypofysen. Voor P5 tot P14 hypofysen, verwijdert u met fijne pincetten en schaar de bindweefselmembraan tussen de zenuwen en het bot en isoleert u voorzichtig de hypofyse samen met de laterale trigeminuszenuwen als een geheel, maar laat de sella turcica achter. Voor P21 en volwassen hypofysen, verwijder de zenuwen en bindweefselmembraan rond de hypofyse en bevrijd de klier van het omliggende weefsel.

Na dehydratie, xyleenklaring en waxinfiltratie volgens het tekstprotocol, verwijdert u op een weefsel-inbeddingsconsolesysteem het specimen uit de cassette en plaatst u het in een basisvorm half gevuld met gesmolten paraffinewas. Voor P21 en volwassen hypofysen, gebruikt u verwarmde fijne pincetten om de hypofyse te positioneren met de korte as loodrecht op het onderoppervlak van een basisvorm. Voor P0 tot P4 hypofysen, oriënteer de specimens met hun sfenoïde botten loodrecht op het onderoppervlak van een basisvorm.

Voor P5 tot P14 hypofysen, oriënteer de specimens met hun trigeminuszenuwen loodrecht op het onderoppervlak van een basisvorm. Na het positioneren van de klier, gebruikt u verwarmde fijne pincetten om het weefsel voorzichtig in de gewenste positie te houden totdat de was semi-solide wordt op een koelplaat. Vul de vorm aan met gesmolten paraffinewas.

Laat de paraffineblok afkoelen tot de was volledig gestold is. Koel de paraffineblok op minus 20 graden Celsius gedurende 10 tot 20 minuten en gebruik vervolgens een microtoom om het in dunne plakjes te snijden, waarbij de positie van de paraffineblok tijdens het snijden fijn wordt afgesteld. Voer immunolabeling uit volgens het tekstprotocol.

Zoals hier getoond, om de hypofyse van de neonatale muis te dissecteren, werd het hele sellaire gebied dat de hypofyse, de trigeminuszenuwen en het onderliggende sfenoïde bot bevat, uit de schedelbasis gedissecteerd. De kleine en delicate hypofyse bleef intact tijdens het proces. Voor muizen ouder dan vijf dagen, werden de hypofysen die aan de laterale trigeminuszenuwen waren gehecht, geïsoleerd.

De groeistructuur van de hypofyse geïsoleerd uit de P7 muis werd goed bewaard. Hier werd de hypofyse van de P21 muis succesvol geïsoleerd zonder zichtbare schade terwijl het omringende weefsel werd verwijderd. In deze figuur toont H&E-kleuring van correct georiënteerde coronale secties een goed bewaarde morfologie van zowel adenohypofyse als neurohypofyse in P0, P7 en P21 hypofysen.

Ten slotte waren de verwerkte slides ook compatibel met immunofluorescencelabeling. Als voorbeeld toonden de adenohypofyse en neurohypofyse specifieke immunolabeling van respectievelijk GH en GFAP. Eenmaal beheerst, kan het proces van dissectie tot inbedding in 7,5 uur worden gedaan bij volwassen muizen en zelfs minder bij jongere muizen als het op de juiste manier wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om het hele sellaire gebied te dissecteren om te voorkomen dat de hypofyse met chirurgische instrumenten wordt aangeraakt. Volgens deze procedure kan de hypofyse die niet is geprefixeerd ook worden geïsoleerd. In dat geval moet meer voorzichtigheid worden betracht om ongewenste schade te voorkomen.

De klier moet ook zo snel mogelijk worden gedissecteerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muishypofysen moet dissecteren en coronale secties van de hypofyse kunt voorbereiden in verschillende ontwikkelingsstadia.