De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van translationeel actieve synaptische neurozones uit de cortex van de muizenhersenen, gebruikmakend van een discontinue sucrose-dichtheidsgradiënt. Dit wordt bereikt door eerst de muizencortices te verzamelen en te homogeniseren, om vervolgens het homogenizaat te centrifugeren. Daarna wordt het gecentrifugeerde homogenizaat, of supernatant, aangebracht op de voorbereide sucrose-gradiënten.

De laatste stap is het centrifugeren en verzamelen van de synaptosomenfractie. Uiteindelijk tonen western blot-analyse en experimenten met S 35 methionine-incorporatie aan dat de synaptosomenfractie synaptisch verrijkt is en translationeel actief is. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals centrifugatie en filtratie zijn enerzijds dat mechanische beschadiging wordt vermeden door het gebruik van dichtheidsgradiënten, en anderzijds dat percoll een lage toxiciteit heeft voor cellen en hun bestanddelen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met dit protocol, omdat de timing een sleutelrol speelt. Zodra de cortices zijn geoogst, moet de procedure snel worden voltooid. Om de procedure te starten, bereidt u de gradiëntlagen van 3, 10, 15 en 23% door de respectievelijke hoeveelheden SIP, zoals beschreven in het bijbehorende manuscript, toe te voegen aan GM-buffer en goed te mengen.

Giet de gradiëntlagen door twee milliliter van elk van de 23 15, 10 en 3% isosmotische peroloplossingen in de Beckman-centrifugebuizen met doppen te pipetteren. Gebruik hiervoor een P 1000-pipet; de interface tussen de lagen moet duidelijk zichtbaar zijn zonder dat de lagen zich mengen. Bewaar de gradiënten bij vier graden Celsius gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik.

Bereid vóór het starten van deze procedure de andere benodigde oplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Euthanaseer de muis in de leeftijd van P 13 tot P 21 en bereid deze voor op dissectie door de nek en het hoofd aan de achterzijde te besproeien met 70% ethanol. Gebruik vervolgens een schaar met een scherpe punt om het ruggenmerg aan de basis van de schedel door te snijden.

Verwijder vervolgens de huid van de bovenkant van de schedel. Snijd de schedel lateraal door tussen het pariëtale bot en het interpariëtale bot, of tussen de gebieden van het cerebrum en de cortex. Snijd daarna de schedel vanaf de basis tot aan de neus langs de sagittale naad.

Verwijder in deze stap voorzichtig het zachte pariëtale bot door elke hemisfeer naar opzij te trekken. Steek daarna de spatel in de hersenen boven het cerebellum om de cortex uit te scheppen. Plaats deze in ijskoud GM-buffer en herhaal de procedures om meer cortices te verzamelen.

Spoel de cortices nu met ijskoude GM-buffer. Breng vervolgens twee cortices over naar een glazen homogenisator met vijf milliliter koude GM-buffer. Homogeniseer de cortices voorzichtig met vijf tot 10 slagen van stamper A, de losse stamper, gevolgd door vijf tot 10 slagen van stamper B, de vaste stamper.

Het aantal slagen varieert afhankelijk van de individuele homogenisator. Overbreng het homogenisaat naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer dit bij 1000 ×g.

Centrifugeer 10 minuten bij 4 °C in een Allegra 6KR-centrifuge om celdebris en kernen te pelletteren. Breng 2 mL van het supernatant aan op elke Percoll- of sucrosegradiënt, met één gradiënt voor elke volledige cortex, en sluit de buizen af. Centrifugeer deze vervolgens in een rotor met vaste hoek bij 32.500 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C in een Beckman J 2-21 centrifuge.

Maak gebruik van geschikte adapters; wanneer het proces is voltooid, moet de gradiënt een sterke SN-band vertonen. Pipetteer de vloeistof boven de SN-band weg en gooi deze oplossing weg. Gebruik een glazen Pasteurpipet om de SN-band bij de interface van 15 tot 23% weg te pipetteren; één gradiënt levert over het algemeen ongeveer 0,9 tot 1,1 milliliter SN op. Breng dit vervolgens over naar een conische buis en bewaar deze op ijs.

Pas vervolgens de zoutconcentratie van de SNS aan door een tiende volume van 10 maal stimuleringsbuffer toe te voegen. Voeg optioneel 1000 maal calciumchloride toe om een eindconcentratie van 12 nano molar te verkrijgen. Voeg daarna een millimolaire TTX-stock toe om een eindconcentratie van één micromolair te verkrijgen om aspecifieke excitatie te onderdrukken.

De volgende stap is het gebruik van de SNS in de toepasbare downstream-applicatie, zoals eiwittranslatiestudies. Voor andere applicaties kan het SN-lysaat worden gezuiverd of geconcentreerd met behulp van de Pierce SDS page sample prep kit. De eiwitconcentratie van de SNS kan worden bepaald met behulp van de micro BCA protein assay kit.

Hier is een voorbeeld van zes banden of fracties. Wanneer de cortex van de muis werd gehomogeniseerd en gescheiden op discontinue percoll-sucrosegradiënten, bevonden de verrijkte SNS zich in band vijf bij de interface van 23 tot 15%; deze band werd verwijderd en onderzocht via elektronenmicroscopie. Een voorbeeld van intacte synaptische blaasjes en het behoud van presynaptische en postsynaptische elementen wordt hier getoond in de western blot.

Een toename van synaptische markers en een afname van onzuiverheden in de SN-band van een discontinue per sucrose-gradiënt worden getoond om te bevestigen dat de toename in de incorporatie van S 35 methionine na toevoeging van glutamaat te wijten is aan de novo eiwitsynthese. 40 micromolar anismycine, een remmer van de eiwitsynthese, werd toegevoegd. Deze figuur laat de sterke afname zien in de incorporatie van S 35 methionine in aanwezigheid van anismycine, met of zonder glutamaat, vergeleken met de basale niveaus.

Zo kunnen discontinue Percoll-sucrosegradiënten snel zeer actieve en relatief zuivere SNS produceren die kunnen worden gebruikt om eiwittranslatie te bestuderen. Deze figuur laat zien dat band vijf uit de discontinue Percoll-sucrosegradiënt de hoogste niveaus van de novo eiwitsynthese bevat. De SNS die is bereid door gehomogeniseerde cortex door een reeks filters met afnemende poriegrootte te leiden en vervolgens te centrifugeren over een discontinue Percoll-sucrosegradiënt, bevat ter vergelijking meer gebroken membranen en minder intacte SNS dan SNS die is bereid met de discontinue Percoll-sucrosegradiëntmethode. Het wordt aangetoond dat SNS die is bereid met de discontinue Percoll-sucrosegradiëntmethode meer de novo eiwitsyntheseactiviteit bevatten dan SNS die met de filtratiemethode is bereid.

Het is aangetoond dat SNS geprepareerd uit jongere muizen een grotere translationele activiteit vertoont dan die uit oudere muizen. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u translationeel actieve synaptische neurozonen kunt isoleren door muiscortices te homogeniseren, het homogenaat te centrifugeren in een swing-out rotor, het supernatant te centrifugeren over een sucrosegradiënt in een vaste-hoekrotor en vervolgens de resulterende synaptische neurozoneband te verzamelen.