Oculaire morfogenese visualiseren door Lightsheet Microscopie met behulp van rx3:GFP Transgene Zebravis

Ons protocol biedt zowel visuele als real-time informatie over hoe het proces van oculaire morfogenese plaatsvindt onder zowel normale als pathologische omstandigheden. Ons protocol maakt de snelle acquisitie van z-stacks mogelijk, waardoor de hoeveelheid tijd tussen elk 3D-beeld in de dataset wordt verminderd. Dit zorgt voor een verhoogde temporele resolutie van hoe oculaire morfogenese optreedt.

Het plaatsen van het embryo in het capillair kan een uitdaging zijn vanwege de bolvorm in het enkele somite-stadium, dus het is belangrijk om meerdere embryo's in het capillair te laden om ervoor te zorgen dat er ten minste één in de juiste oriëntatie is. Om te screenen op de aanwezigheid van somites 10 uur na de bevruchting, plaatst u de embryo's onder een stereomicroscoop en gebruikt u een fluorescentieadapter om de aanwezigheid van het rx3:GFP-transgen te bevestigen. Zodra drie tot vijf GFP-positieve single somite embryo's zijn geïdentificeerd, gebruik je een fijne tang om de embryo's te versieren.

Om de embryo's in agarose in te bedden, breng je de embryo's over naar een microcentrifugebuis met 500 microliter E3-embryobuffer aangevuld met 168 microgram per milliliter tricaïne en voeg je 500 microliter gekoelde maar vloeibare 2% lage smelttemperatuur agarose en E3-buffer toe aan de buis met zachte menging. Gebruik een glazen capillair van één millimeter met een PTFE-zuiger om de in agarose ingebedde embryo's in het capillair te trekken en laat de agarose 30 tot 60 seconden stollen bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens het capillair in een bekertje met tricaïne aangevulde E3-buffer.

Om een lightsheetmicroscoop voor embryografische beeldvorming in te stellen, plaatst u het capillair in de capillaire monsterhouder en klikt u op de metalen mantel in het midden van de metalen schijf van de houder. Plaats twee rubberen stoppen in de mantel met de spleten naar de uiteinden van de schede gericht en schuif het capillair door het midden van de rubberen stoppen. Zodra de marker zich aan de basis van de metalen mantel bevindt, gebruikt u de metalen dop om het capillair op zijn plaats te houden en plaatst u de houder op de bovenkant van de microscoop met de witte vlekken uitgelijnd.

Sluit het deksel van de monsterhouder en klik op de knop Locate capillary in de microscoopsoftware-interface. Gebruik het Ergo Drive-bedieningspaneel om het capillair tot net boven het doel te verplaatsen. Na het openen van het deksel, duwt u voorzichtig op de zuiger totdat het gedeelte van agarose met het embryo onder de capillaire bodem voor het doel hangt.

Schakel locate capillary uit en klik op Locate sample om de weergave van de webcam van de monsterkamer naar het microscoopobjectief te schakelen en gebruik deze weergave om de positie van het monster nauwkeuriger aan te passen. Schakel vervolgens het zoekmonster uit en ga naar het tabblad Acquisitie. Vink de vakjes z-stack en tijdreeks aan.

Selecteer in het venster parameters van de acquisitiemodus de instelling dual side lightsheet en vink de vakjes aan voor online dual side fusion en pivot scanning. Klik continu om een live beeld van het embryo te krijgen. Selecteer in het venster van het kanaal 488-kanaal en stel het laservermogen in op één en de belichtingstijd op 7,5 milliseconden.

Gebruik het Ergo Drive-bedieningspaneel om de positie van het embryo aan te passen totdat het oogveld direct naar de camera is gericht en pas de linker- en rechterlichtbladen in de kanaalparameters aan totdat het oogveld voldoende scherp is. Stel de eerste en laatste z-posities in op ongeveer 500 micrometer voorbij het laatste detecteerbare fluorescerende signaal en klik optimaal om de stapgrootte in te stellen op 0,477 micrometer. Om de incubatieparameters in te stellen, vinkt u het vakje aan voor de Peltier-eenheid om de temperatuur op 28 graden Celsius te houden.

Selecteer in het tijdreeksvenster de juiste experimentele frequentie en het juiste tijdsinterval om de beelden te verkrijgen. Klik op Experiment starten. Selecteer de map om de afbeeldingenset op te slaan en het voorvoegsel van de afbeelding in te stellen en klik vervolgens op Opslaan om de afbeelding te starten.

Voor beeldanalyse importeert u de afbeeldingsbestanden in een geschikt softwareprogramma voor 4D-beeldanalyse en klikt u op de 4D-viewerkubus, de schaalbalk en het videopictogram om de taakbalk van het storyboard te openen. Selecteer Hoofdframereeks toevoegen en geef de duur van de video in seconden op. Verwijder het vinkje uit het selectievakje Rotatie maken en schakel tijdprogressie gebruiken in om specifieke tijdpunten in de video op te nemen.

Sla het storyboard op om dezelfde parameters toe te passen op meerdere afbeeldingensets. Klik op Film exporteren om een video van de timelapse-afbeelding op te slaan en geef de filmexportinstellingen op, inclusief de bestandsnaam en locatie, video-indeling, videoresolutie, framesnelheid, gegevensresolutie. Voeg desgewenst tijdstempels toe en selecteer record.

Als u rotatievideo's op specifieke tijdstippen wilt maken, voegt u een hoofdframereeks toe zoals zojuist gedemonstreerd, maar schakelt u het selectievakje Rotatie maken in en schakelt u het selectievakje Voortgang van de gebruikstijd uit. Als u een afbeelding met een hoge resolutie in elke richting en op elk afzonderlijk tijdstip wilt weergeven, selecteert u het camerapictogram in de 4D-viewer. Als u een pijplijn voor analyse wilt bouwen, selecteert u kolf om toegang te krijgen tot het analysepaneel en opent u het menu analysebewerkingen om de volgorde van interessante bewerkingen te selecteren.

Klik op het blauwe driehoekje om de pijplijn te starten. Klik aan het einde van de uitvoering op functiekolommen in het pop-upvenster om een lijst met functies weer te geven die informatie kunnen bieden over het object van interesse en klik vervolgens op Exporteren om de gegevens naar een spreadsheet te exporteren. In deze representatieve analyse werd elke vijf minuten vanaf het ene somite-stadium gedurende 24 uur na de bevruchting gedurende in totaal 14 uur een transgeen rx3:GFP-embryo in beeld gebracht vanuit het dorsale gezichtspunt.

Zoals waargenomen, vergemakkelijkte het uitvoeren van een pijplijnrun van de beelden die uit deze analyse werden vastgelegd de generatie van een masker van het zich ontwikkelende oog. Merk op dat wanneer het oogveld wordt gescheiden in twee optische blaasjes, een derde rx3: GFP-positief gebied in de voorhersenen dat heeft bijgedragen aan de hypothalamus kan worden waargenomen. Deze informatie werd ook waargenomen in de volumegegevens en kan gemakkelijk worden gescheiden van de optische blaasjesgegevens, omdat deze veel kleiner in volume was dan die waargenomen voor beide optische blaasjes.

Deze procedure kan worden gevolgd door aanvullende analyses, bijvoorbeeld het volgen van individuele cellen in de beelddataset.