Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Autoradiografie is een krachtige en eenvoudige techniek om de verspreiding van eiwitbindende sites in weefsels te bestuderen met behulp van specifieke radioligen voor het doel. Het is ook een geschikt alternatief voor immunohistochemie. Deze techniek visualiseert eiwitexpressie met ruimtelijke resolutie via digitale beelden die sneller zijn dan traditionele filmbelichting.

Het kan ook worden gebruikt voor farmacologische analyse van eiwitdoelen. De methode omvat muisweefsels gemonteerd op glas, maar kan worden uitgebreid tot andere soorten of zelfs tot cellen geteeld op coverslips. Het demonstreren van de procedure zal worden door Nane Griem-Krey, een promovendus in mijn laboratorium.

Om te beginnen dompelt u het weefsel onder in droog ijs in poedervorm om het te bevriezen. Breng het bevroren weefsel rechtstreeks naar een cryostat die is ingesteld op min 20 graden Celsius. Laat het weefsel 20 minuten wennen tot min 20 graden Celsius in de cryostat.

Bedek vervolgens de weefselhouder met inbeddingsmedium buiten de cryostat en plaats het bevroren weefselmonster snel in de gewenste oriëntatie terwijl het inbeddingsmedium nog vloeibaar is. Breng de weefselhouder terug naar de cryostat en stel het inbeddingsmedium bloot tot temperaturen onder min 10 graden Celsius voor verharding. Plaats de weefselhouder in het microtome van de cryostat.

Pas de oriëntatie van het weefsel aan om schuine secties te voorkomen. Snijd het weefsel met de begeleiding van een stereotaxic atlas in secties van de gewenste dikte en ontvouwen de sectie met een kleine borstel indien nodig. Dooi zet het gedeelte op een microscoopplaat.

Dan achtereenvolgens verzamelen van de secties uit de regio van belang voor de gewenste technische herhaling. Laat de secties op de glijbanen een uur drogen voordat u verder worden behandeld. Gebruik in een gecertificeerd radioactiviteitslaboratorium een potlood om de dia's te labelen met de experimentele omstandigheden.

Plaats de glijbanen horizontaal in plastic trays. Breng zorgvuldig een passend volume SA-buffer toe dat is aangepast aan het doel in kwestie op de secties die op de dia's zijn gemonteerd. Zorg ervoor dat elke sectie volledig is afgedekt.

Voor de bepaling van niet-specifieke binding, vul SA buffer met een relevante concentratie van niet-gelabelde verbinding. Bedek vervolgens de trays met deksels om verdamping te voorkomen. Pre-incubeer bij een relevante temperatuur gedurende 30 minuten op een plaatshaker ingesteld op 20 rpm.

Giet vervolgens de pre-incubatievloeistof van elke dia af en breng de dia's terug in de plastic lade. Bedek de secties onmiddellijk volledig met de relevante concentratie van radioligen in SA-buffer. Voor de bepaling van niet-specifieke binding, aanvulling radioligen oplossing met een relevante concentratie van niet-gelabelde verbinding.

Bedek de trays met deksels en uitbroed onder de gewenste omstandigheden met constant zacht schudden bij 20 tpm. Giet hierna de incubatieoplossing af en breng de dia's in een microscoopdiarek. Was onmiddellijk de glijbanen.

Voor het GHB-protocol, was twee keer met ijskoude SA buffer gedurende 20 seconden en spoel vervolgens twee keer door het dompelen van de schuifrek in trays gevuld met ijskoud gedestilleerd water. Plaats de glijbanen minstens een uur verticaal in rekken en de lucht drogen. Breng de dia's vervolgens over naar een fixator met paraformaldehyde voor nachtelijke fixatie bij kamertemperatuur.

Breng de dia's de volgende dag over op een desiccatorbox met silicagel op kamertemperatuur. Laat de glijbanen drie uur in de desiccatorbox staan om vocht te elimineren. Plaats eerst de secties in een stralingsafschermde imagingplaatcassette met het weefsel naar boven gericht.

Neem een radioactieve microschaal op in elke cassette voor latere kwantificering van radioligen binding. Laad onmiddellijk voor gebruik de tritiumgevoelige fosforbeeldplaat in de fosforbeeldmachine en stel deze bloot aan zichtbaar infrarood licht volgens de instructies van de fabrikant om het te wissen. Verwijder vervolgens de beeldplaat van de fosforbeeldmachine en plaats deze onmiddellijk op de delen in de cassette.

Zorg ervoor dat de cassette volledig gesloten is. Stel de secties bloot aan de fosforbeeldvormingsplaat voor de geoptimaliseerde belichtingstijd bij kamertemperatuur terwijl ze zijn afgeschermd van licht. Na blootstelling, open de cassette voorzichtig in het donker en breng de beeldplaat onmiddellijk over in de donkere doos van een fosforbeeldcamera.

Scan de plaat met de hoogst mogelijke resolutie om een digitaal beeld te verkrijgen. Open om te beginnen een geschikt beeldanalyseprogramma. Bepaal de relatieve optische dichtheden voor elke kalibratiestandaard door de bepaling van het menu-itemgebied te selecteren.

Selecteer het gereedschap voor het maken van regio's en gebruik het om een gebied van gelijke grootte te selecteren voor elk punt van de radioactieve microschaal. Wijs een getal toe aan elk geselecteerd gebied door op nummer onder het menu-itemlabel te klikken. Klik op Bestandsexport en vervolgens op 2D-regiorapport om de OD-waarden voor elk punt van de kalibratienorm te exporteren.

Gebruik in de gepatenteerde beeldvormingssoftware een regiocreatietool om het interessegebied in elke sectie te selecteren en de ED's te meten om te beginnen met het uitvoeren van kwantificering van de autoradiogrammen. Selecteer hetzelfde gebied in elke sectie door een sjabloon te maken voor het gebied van belang en kopieer en pas deze aan kleine variaties in de anatomie van de hersenen in elk autoradiogram. Klik hierna op 2D-regiorapport bestand exporteren om de STAAFwaarden en -grootte van geselecteerde gebieden naar een spreadsheet te exporteren.

Bepaal de binding van de radioligen zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie, de anatomische verdeling van de hoge affiniteit GHB binding sites worden gevisualiseerd met de radiogelabelde GHB analoge radioactieve HOCPCA in een muis hersenen die werd gesneden in coronale, sagittale, en horizontale secties. Hoge bindingsniveaus worden gezien in de hippocampus en cortex, terwijl lagere bindingsniveaus worden gezien in het striatum en er geen binding wordt gedetecteerd in het cerebellum.

Zoals hier getoond, kunnen de anatomische structuren worden gevisualiseerd met behulp van verschillende vlakken en anatomische integriteit kan worden ondersteund door cresyl violette kleuring. Representatieve autoradiogrammen van een rat, een muis en een varken illustreren het evolutionaire behoud van de hoge affiniteit GHB bindende sites in het zoogdierbrein. Radioactieve HOCPCA binding sites worden gedetecteerd in alle drie de soorten waardoor vergelijking van de bruto hersenen anatomie tussen hen.

De hoge affiniteit GHB binding sites zijn onderzocht met GHB radioligands die verschillende affiniteiten voor de binding sites, maar vergelijkbare specifieke activiteiten weer te geven. Radioactieve HOCPCA is begiftigd met een hoge gevoeligheid en een uitstekende signaal-ruisverhouding. Vanwege de lagere gevoeligheid van radioactieve NCS-382 moeten hogere radioligen concentraties en concentraties worden gebruikt om vergelijkbare bindingsniveaus te verkrijgen.

Nog hogere radioligen concentraties zijn nodig om radioactieve GHB vergelijkbare bindingsniveaus te bereiken. Hogere radioligies en concentraties verhogen echter ook het niveau van niet-specifieke binding met een bijgevolg lagere signaal-ruisverhouding. Het is belangrijk om de testomstandigheden zoals de radioligen concentratie, was- en belichtingstijd te optimaliseren om de beste signaal-ruisverhoudingen te krijgen en het is ook erg belangrijk om te onthouden om de plaat eerder te wissen.

De procedure kan worden uitgebreid tot in vivo omstandigheden om een idee te krijgen over verbindingsbinding in een levend dier, wat nuttig kan zijn voor ontdekkingsprojecten. Vergeet niet om te werken in een laboratorium met gecertificeerd volledig radioactief materiaal en om beschermende kleding te dragen bij het hanteren van radioactiviteit of paraformaldehyde.