In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen
4 december 2020
In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.
Bestaande in vitro-methoden om migratie van MSC's te onderzoeken, omvatten Transwell- of wondgenezingsprotocollen. De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de migratie van MSC's naar explant in realtime te volgen. In termen van explantcultuur is het voordeel van deze methode vergeleken met andere dat het een vermindering van tijd en kosten bereikt, evenals een vereenvoudiging van experimentele stappen.
Deze techniek kan worden gebruikt om stamcel-homing naar het doel in realtime te observeren, wat leidt tot de ontwikkeling van modellen met geoptimaliseerde homing-efficiëntie. Het verwijderen van het tectoriale membraan is moeilijk voor onervaren onderzoekers. Afhankelijk van de ontwikkelingsfase, is het belangrijk om het juiste moment te begrijpen om het tectoriale membraan te verwijderen voor het succes van dit protocol.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Jeong-Eun Park en Dr. Su Hoon Lee, onderzoeksprofessoren van mijn lab. Begin met het steriliseren van de weefselkweekhood met laminaire stroming door de ultraviolette lamp ongeveer 30 minuten aan te zetten. Spuit alle oppervlakken met 70% ethanol voor gebruik en laat ze drogen.
Plaats de dissectie-instrumenten in 70% ethanol gedurende 10 minuten en droog ze vervolgens voor gebruik. Nadat een muis van drie tot vier dagen oud is onthoofd, week het hoofd in 70% ethanol en plaats het onder een seriële microscoop in de hood met laminaire stroming. Week het weefsel snel in weefseldissecteringsoplossing om het ethanol te verwijderen.
Snijd de middenlijn van de schedel met het chirurgische mes, stel de schedel bloot door de huid naar voren te trekken en de externe gehoorgang van het oor door te snijden. Snijd van het voorste naar het achterste deel van de schedel over de ooglijn, open vervolgens de schedel en verwijder de voorhersenen, het cerebellum en de hersenstam met stompe pincetten. Gebruik micropincetten om de cochlea van het tijdelijke bot te scheiden en breng deze over in een petrischaal met weefseldissecteringsoplossing.
Dissecteer voorzichtig alle cochleaire otische capsule en laat alleen het interne cochleaire zachte weefsel achter. Houd de modiolus van de cochlea vast met pincetten en het cochleaire kanaal met een ander paar pincetten, scheid vervolgens langzaam de twee weefsels. Verwijder de stria vascularis en het tectoriale membraan door ze voorzichtig weg te pellen.
Plaats een gesteriliseerde plastic dekglas in nieuwe weefseldissecteringsoplossing en plaats het orgaan van Corti op het dekglas en zorg ervoor dat de basilaire membraan naar beneden wijst. Immobiliseer het weefsel door de Reissner-membraan en het resterende modiolusweefsel met pincetten op het dekglas te drukken. Breng het dekglas met het ingebedde weefsel naar het midden van een confocale schaal van 35 millimeter.
Plaats de glazen kloningscilinder op de schaal met het cochleaire explant in het midden van de schaal en voeg 100 microliter explantkweekmedium toe aan de cilinder. Plaats 5.000 beenmerg-afgeleide GFP-getagde mesenchymale stamcellen of MSC's in twee milliliter kweekmedium buiten de glazen cilinder en zet de schaal in de incubator. Nadat de cellen zijn gekweekt zoals beschreven in het tekstmanuscript, zuig al het medium binnen en buiten de cilinder af en verwijder de glazen cilinder uit de confocale schaal.
Voeg twee milliliter vers kweekmedium toe aan de schaal. Plaats deze in een bevochtigde incubator totdat het klaar is voor analyse. Gebruik een confocale microscoop met een incubatorhoofd met trappen.
Zet de confocale microscoop, fluorescentielicht en computer aan. Stel de omstandigheden van de incubatorhoofd in op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide-atmosfeer. Plaats de monsterschaal op de schaalbevestigingsvat, bedek deze met het schaalbevestigingsdeksel en sluit de kamer met het bovenste verwarmingsdeksel.
Stel de zoom en focus in om het orgaan van Corti en MSC's in het gezichtsveld te lokaliseren. Open de software voor beeldverwerking. Selecteer onder de locatie-optie een 20X plan-apochromat-objectief of numerieke apertuur 0,8 en een 0,5X-opnamegebied.
Onder verwerving, klik op slimme setup en selecteer EGFP. Open het kanaaltabblad onder verwerving en stel de laservermogen in op 0,2%, de pinhole op 44 micrometer, de masterversterking op 750 volt en de digitale versterking op 1,0. Klik op ESID onder beeldopname-instellingen en stel de ESID-versterking in op vier en de digitale versterking op 7,5.
Klik op tegels en stapel om 210 tegels te produceren. Open focusstrategie en selecteer de focusmodus. Onder tijdreeksen stelt u de duur in op 24 uur en het interval op 10 minuten.
Onder verwerving stelt u de framegrootte in op 512 bij 512 pixels, scannelheid op acht, de richting op tweerichtings, het gemiddelde op 4X en de bits per pixel op 16. Klik op experiment starten om het experiment te beginnen. De tweedimensionale pad van mesenchymale stamcellen of MSC's werd gevolgd in een wondgenezingsmethode door een glazen cilinder te gebruiken als een barrière tussen de MSC's en het orgaan van Corti.
Toen het orgaan van Corti werd gekweekt, groeiden fibroblasten zeer snel naar buiten van de buitenste haarcellen in de buitenste laag. De meeste GFP-gelabelde MSC's werden door snel groeiende fibroblasten naar buiten geduwd. Desondanks drong een deel van de fibroblastenlaag binnen en migreerde met succes naar het orgaan van Corti.
De resultaten van 72 uur incubatie toonden aan dat MSC's naar het orgaan van Corti migreerden en voornamelijk gelokaliseerd waren in de modiolus en het gebied met de cochleaire zenuwvezels gescheiden van de modiolus. De morfologie van de MSC's werd veranderd in een radiale vorm, vergelijkbaar met die van zenuwvezels. De cellen werden getransformeerd in een lineaire vorm langs de limbuslijn, in plaats van het haarcelgebied.
De MSC's waren in staat om te migreren en te groeien in het verzamelingsgebied van zenuwvezels door de verschillende cell
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een real-time beeldgevingsmethode met behulp van confocale microscopie om de migratie van cellen naar beschadigd weefsel te observeren. De techniek maakt het mogelijk om de homing van stamcellen naar doelweefsels in real-time te volgen, wat inzicht geeft in de dynamiek van celmigratie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celmigratie
- Stamcelonderzoek
- Real-time imagingtechnieken
Achtergrond
- Bestaande in vitro-methoden voor het bestuderen van celmigratie omvatten Transwell- en wound healing-protocollen.
- Deze studie richt zich op een methode die het experimentele proces vereenvoudigt.
- Inzicht in het juiste tijdstip voor het verwijderen van het tectoriaal membraan is cruciaal voor een succesvolle toepassing van het protocol.
- De methode is erop gericht de tijd en kosten die gepaard gaan met traditionele technieken te verminderen.
Doel van het onderzoek
- Om een real-time beeldgevingsmethode te ontwikkelen voor het observeren van MSC-migratie.
- Om het begrip van de efficiëntie van stemcel-homing te verbeteren.
- Om een vereenvoudigd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Confocale microscopie voor real-time imaging.
- Ex vivo incubatie met cochleair epitheel.
- Tracking van MSC's richting explantaten.
- Verwijdering van het tectoriaal membraan als onderdeel van het protocol.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle real-time tracking van MSC-migratie.
- Aangetoonde voordelen ten opzichte van traditionele methoden.
- Inzichten verschaft in de timing van de verwijdering van het tectoriaal membraan.
- Facilitering van de ontwikkeling van modellen met een geoptimaliseerde homing-efficiëntie.
Conclusies
- De methode biedt een kosteneffectieve en efficiënte aanpak om celmigratie te bestuderen.
- Real-time imaging verbetert het begrip van de dynamiek van stamcellen.
- Toekomstige toepassingen kunnen leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Real-time live-cell imaging van de migratie van mesenchymale stamcellen (MSC) naar het orgon van Corti biedt bruikbare inzichten voor vroege stadia van ontdekkingen in de regeneratieve geneeskunde. Deze methode maakt directe visualisatie mogelijk van cell-homing, morfologische adaptatie en de respons op weefselbeschadiging, wat de voorspellende betrouwbaarheid van celgebaseerde therapeutische strategieën ondersteunt. De gestroomlijnde workflow en kwantitatieve resultaten maken het een waardevol instrument voor targetvalidatie en mechanische risicoreductie in preklinische R&D-portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe observatie van MSC-homing en integratie met cochleaire weefselexplantaten mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door migratiepatronen en morfologische veranderingen onder letselcondities te onthullen.
- Faciliteert functionele validatie van targets voor celgebaseerde regeneratieve benaderingen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar, kwantitatief platform voor het beoordelen van de migratie en lokalisatie van MSC's.
- Standaardiseert de condities voor live-cell imaging voor vergelijkende analyse tussen verschillende experimentele variabelen.
- Maakt screening mogelijk van factoren die de efficiëntie van stemcel-homing en weefselinteractie beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde modellen door scenario's van cochleaire beschadiging en herstel te simuleren.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers via morfologische en lokalisatie-readouts.
- Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door real-time tracking van het gedrag van therapeutische cellen mogelijk te maken.
Integratie van pijplijn en workflow
Deze methode voor live-cell imaging is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothesegestuurd testen van celmigratie, weefseltargeting en regeneratief potentieel mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Kwantificeert de migratiedynamiek en morfologische aanpassing van MSC's als reactie op weefselsignalen en letsel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare migratie-assays die geschikt zijn voor het evalueren van kandidaatfactoren of condities.
- Analytics: Biedt tijd-lapse kwantitatieve gegevens over cellokalisatie, morfologie en migratiebanen.
- Translationeel onderzoek: Modelleert ziekterelevante weefselomgevingen en responsen op letsel voor preklinische beoordeling.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een flexibel platform dat aanpasbaar is aan andere celtypen of weefselexplantaten voor breder regeneratief onderzoek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in celgebaseerde regeneratieve strategieën en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Vermindert de experimentele complexiteit, tijd en kosten in vergelijking met traditionele migratie-assays.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door realtime, kwantitatief bewijs van celgedrag te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van celtherapie-kandidaten en regeneratieve benaderingen mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging en weefseldissectie, in het bijzonder voor cochleaire explantaten.
- Vereist toegang tot confocale microscopie met omgevingsbeheersing voor langetermijn-imaging.
- Standaardisatie van weefselimmobilisatie en membraanverwijdering is cruciaal voor de reproduceerbaarheid.
- Aanpassing aan andere weefselmodellen kan protocoloptimalisatie voor de hantering van explantaten vereisen.
- Fysieke barrières en overgroei van fibroblasten kunnen de migratie-readouts beïnvloeden en moeten worden beheerst.
