Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit is een model voor retinale ziekte en emuleert het in vivo netvlies. Tot op zekere hoogte zou het dierproeven kunnen vervangen. Het protocol is geoptimaliseerd voor de kwaliteit en kwantiteit van de voorlopers van de fotoreceptor in de retinale organoïden, en de fotoreceptor is de sleutel tot verschillende onomkeerbare blindheidsaandoeningen.

Begin met het kweken van de menselijke embryonale stamcellen, of hESCs, onder feedervrije omstandigheden. Om dit te doen, bedekt u een put van een zesputtenplaat met één milliliter van 100 microgram per milliliter reagens A en incubeert u de plaat gedurende ten minste een half uur bij 37 graden Celsius. Ontdooi een aliquot van een miljoen hESCs en centrifugeer het gedurende vijf minuten op 200 xg.

Na het verwijderen van het supernatant, zaaien de cellen in de eerder gecoate plaat, samen met twee milliliter reagens B.Passeer de cellen na het bereiken van ongeveer 80% samenvloeiing na ongeveer vier dagen. Nadat u de samenvloeiing hebt bereikt, wast u de cellen met voorverwarmd DPBS en brengt u ze over in 500 microliter vers bereid reagens. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 3,5 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Maak de cellen los door een paar seconden met de zijkant en onderkant van de plaat te vegen en voeg 500 microliter voorbereid medium één toe. Oogst de losgemaakte cellen in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en pipetteer de celsuspensie op en neer. Voeg voor het tellen van cellen 100 microliter celsuspensie toe aan 900 microliter DPBS.

Verdun de 900 microliter van de resterende celsuspensie met medium één in de petrischaal om negen keer 10 tot de vierde krachtcellen per milliliter te bereiken. Voeg 100 microliter verdunde celsuspensie toe aan elke put van een niet-hechtende, V-bodem, 96-well plaat. Draai de plaat gedurende vijf minuten lichtjes op een schudder met lage snelheid en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot dag twee.

Voeg op dag twee 20 microliter 1% reagens A toe aan elke put van de 96-well plaat en pipetteer twee keer in het midden om de dode cellen te verspreiden. Reinig de bodem van de plaat voordat u deze incubeert bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot dag zes. Vervang op dag zes 58 microliter van het medium door 60 microliter vers medium één en ga verder met de incubatie.

Oogst op dag 12 de celpellets van de 96-well plaat in een conische buis van 15 milliliter en laat de pellets vijf minuten op natuurlijke wijze bezinken bij kamertemperatuur. Wanneer pellets bezinken, verwijdert u het supernatant zonder de organoïden te verstoren en brengt u de celaggregaten over naar een suspensieschaal van 10 centimeter met 18 milliliter medium twee met reagens A.Incubateer de schaal op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot dag 18. Bevestig op dag 18 de generatie van een semi-transparant optisch blaasje in de schaal en snijd de gegenereerde organoïden met een microchirurgisch mes.

Verzamel alle gesneden pellets naar het midden van het gerecht. Oogst vervolgens de cellen in een conische Falcon-buis van 15 milliliter. Wanneer de cellen bezinken, verwijdert u voorzichtig het supernatant en resuspenseert u de pellets in twee petrischalen van 10 centimeter met 18 milliliter medium, drie per schaal.

Breng de gerechten voorzichtig over naar de incubator om celaggregatie te voorkomen. Ga door met het kweken van de cellen en verander het medium wekelijks. Analyseer de CRX-expressie na dag 45 tot dag 120.

In deze representatieve analyse worden verschillende stadia van de menselijke retinale generatie weergegeven. Op dag zes verschenen organoïden als een aggregaat van dichte verbindingen in een heldere rand met een diameter van ongeveer 600 micrometer. Op dag 12 vond de eerste generatie van de optische blaasjesachtige structuren plaats.

De organoïden zonder de juiste blaasjesachtige architectuur werden weggegooid voordat ze op dag 18 in een petrischaaltje werden gekweekt. Tegen dag 30 van de cultuur was de blaasjesachtige architectuur duidelijker en konden inferieure RO's gemakkelijk worden onderscheiden en verwijderd. Vanaf dag 45 drukten de organoïden verschillende markers van voorlopers van fotoreceptoren uit, zoals CRX, RCVRN en OTX2.

Door de superieure retinale organoïden te splitsen, wordt de differentiatie-efficiëntie aanzienlijk verbeterd en kunnen meer dan 100 superieure organoïden uit 96 platen worden geoogst.