Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming
2 september 2021
Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.
Deze methode is ontworpen om contactafhankelijke concurrentie te kwantificeren via het type VI-secretiesysteem tussen bacteriestammen op het niveau van één cel. Deze techniek maakt gebruik van het totale celoppervlak in plaats van celtellingen om bacteriële competities te kwantificeren, waardoor het gemakkelijk wordt voor onderzoekers zonder toegang tot eigen beeldanalysesoftware. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om de concurrentie tussen diverse kweekbare microben te kwantificeren.
Bovendien kan de experimentele opstelling worden geoptimaliseerd voor gebruik op rechtopstaande of omgekeerde microscopen. Bereid om te beginnen de agarose pad-oplossing voor door 2% laagsmelt agarose op te lossen in mariene PBS. Verwarm de oplossing kort gedurende ongeveer 30 seconden in de magnetron en vortex totdat de agarose volledig is opgelost.
Bewaar deze oplossing in een waterbad van 55 graden Celsius totdat deze klaar is voor gebruik. Wikkel vervolgens vijf keer een stuk laboratoriumtape rond een glazen dia. Herhaal het omwikkelen van tape op dezelfde dia, zodat de afstand tussen de twee tapestukken iets kleiner is dan de breedte van de coverslip.
Om een vlak agarose padoppervlak te garanderen, pipetteer warme agarose-oplossing tussen de twee stukken tape en plaats onmiddellijk een coverslip bovenop, zodat de coverslip contact maakt met de vloeistof en eventuele bubbels in de agarose-oplossing naar buiten duwt. Laat de agarose pad minstens een uur stollen bij kamertemperatuur. Snijd vervolgens deze agarose pad met een scheermesje in vier 5 vierkante millimeter pads om te gebruiken voor beeldvorming.
Om de stammen voor te bereiden op co-incubatie, streept u elke stam uit bevroren voorraden op de LBS-agarplaten aangevuld met de juiste antibiotica en incubeert u 's nachts bij 24 graden Celsius. Kies de volgende dag twee kolonies van elke stam en resuspend de kolonies in antibioticum aangevuld LBS-medium. Incubeer geresuspendeerde kolonies 's nachts bij 24 graden Celsius met schudden met 200 rotaties per minuut.
De volgende ochtend repliceert subcultuur elke biologische één in 1.000 keer vers LBS-medium zonder antibiotica en incubeert totdat cellen een optische dichtheid van ongeveer 1,5 bij 600 nanometer bereiken. Meet en registreer de optische dichtheid op 600 nanometer voor alle monsters. Normaliseer elk monster tot een optische dichtheid van één door de cultuur te verdunnen met LBS-medium.
Meng de twee concurrerende stammen in een gelijke verhouding door 30 microliter van elke genormaliseerde stam toe te voegen aan een gelabelde buis van 1,5 milliliter. Vortex de gemengde soortcultuur gedurende één tot twee seconden. Meng de concurrerende stammen voor elke biologische replicatie en behandeling om in totaal vier gemengde stambuizen te genereren.
Concentreer elke gemengde cultuur drievoudig door te centrifugeren om te zorgen voor voldoende dichte concurrerende cellen voor contactafhankelijke doding tijdens co-incubatie. Gooi het supernatant weg, resuspend elke pellet in 20 microliter LBS-medium en voer concentratieprocedures uit voor elk monster. Als u een omgekeerde microscoop afbeeldt, begint u met het spotten van twee microliter van een gemengde cultuur op de nummer 1,5 coverslipbodem van een petrischaaltje van 35 millimeter en plaatst u de agarose-pad over de co-incubatieplek.
Plaats een 12 millimeter ronde glazen afdekplaat over de agarose pad. Herhaal het spotten en plaatsen van coverslip voor de resterende drie gemengde culturen, wat resulteert in vier gerechten die in beeld worden gebracht. Voordat u verder gaat, laat u de dia's ongeveer vijf minuten op het bankje zitten om de cellen op de agarpad te laten bezinken om beweging tijdens het beeldvormingsproces te voorkomen.
Begin met het focussen op cellen die DIC gebruiken om fotobleekende effecten te minimaliseren. Gebruik op basis van de gemiddelde grootte van een enkele bacteriële cel een oliedoelstelling van 100X. Pas de belichtingstijd en acquisitie-instellingen voor elk kanaal aan met minimale achtergronddetectie.
Selecteer ten minste vijf weergavevelden en verkrijg afbeeldingen in elk geschikt kanaal. Open de beeldanalysesoftware en importeer de te analyseren afbeeldingsbestanden. Converteer de afbeelding naar grijswaarden, scheid de kanalen en begin met het drempelwaarden en maken van een binair masker van de voorbewerkte afbeelding.
Selecteer Analyseren en selecteer vervolgens in het vervolgkeuzemenu schaal instellen en voer de juiste waarden in voor de microscopie-instelling. Ga vervolgens naar metingen instellen en selecteer Gebied. Selecteer op het tabblad Analyseren de optie Deeltjes analyseren met behulp van de standaardinstellingen.
Als er vuil in het monster aanwezig is, kan de grootte of circulariteit worden aangepast om niet-celdeeltjes eruit te filteren. Selecteer Weergeven en vervolgens Contouren zodat de uitvoer van filteranalyse een genummerd overzicht van alle geanalyseerde deeltjes bevat. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware voor verdere analyse en grafieken.
De representatieve fluorescentiebeelden van elke experimentele behandeling worden getoond. Het concentreren van gemengde cultuur vóór spotting resulteerde in afgeronde of verdwenen doelcellen gedurende twee uur, wat wijst op succesvolle remming. Wanneer de gemengde cultuur niet geconcentreerd is, blijven cellen verspreid op de dia.
Zonder voldoende cel-tot-celcontact wordt de doelstam niet geremd door de dodelijke stam. De doelcellen verdwenen niet en werden niet afgerond wanneer ze samen met een T6SS-mutant in drukke of verspreide omstandigheden werden geïncubeerd. Het doelwit was dus onbevangen in beide behandelingen.
De deeltjesanalyseresultaten werden in een grafiek weergegeven en geanalyseerd voor zowel doelstam als inhibitorstam. Meer dan 100% van het oorspronkelijke doelgebied op het laatste tijdstip betekent een nettotoename van het streefcijfer en minder dan 100% van het oorspronkelijke doelgebied duidt op een nettodaling van het streefcijfer. De nettogroei van de inhibitorstam werd waargenomen bij alle behandelingen.
Het percentage van het oorspronkelijke gebied voor de inhibitorstam was echter significant hoger wanneer een wild-type remmer werd geco-geïncubeerd met het doelwit in drukke omstandigheden in vergelijking met alle andere behandelingen. Om duidelijke beelden te krijgen, moet de agarose pad zo plat mogelijk zijn. Knip stukjes tape voordat je ze om de dia wikkelt om ervoor te zorgen dat ze dezelfde lengte hebben.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol op basis van fluorescentiemicroscopie om interbacteriële competitie op enkelcelniveau te visualiseren en te kwantificeren. De methode richt zich op contactafhankelijke competitie, specifiek via het type VI-secretiesysteem, waarbij gebruik wordt gemaakt van metingen van het totale celoppervlak in plaats van celtellingen. De aanpak is aanpasbaar voor gebruik met zowel rechtopstaande als geïnverteerde epifluorescentiemicroscopen en is compatibel met diverse kweekbare bacteriële stammen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Microbiële interacties
Achtergrond
- Interbacteriële competitie vormt de structuur en functie van het microbioom.
- Het type VI-secretiesysteem (T6SS) medieert contactafhankelijk bacterieel antagonisme.
- Traditionele kwantificeringsmethoden vereisen vaak propriëtaire software of richten zich op celcounts.
- Er is behoefte aan toegankelijke, reproduceerbare methoden om bacteriële competitie te bestuderen met resolutie op enkelcelniveau.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen en beschrijven van een op microscopie gebaseerd protocol voor het kwantificeren van bacteriële competitie met behulp van metingen van het celoppervlak.
- Het bieden van een methode die toegankelijk en aanpasbaar is voor diverse bacteriële systemen.
- Het mogelijk maken van de visualisatie en kwantificering van competitieve interacties tussen symbiotische Vibrio fischeri-stammen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van agarosepads voor het monteren van preparaten met behulp van low melt agarose in mariene PBS.
- Co-incubatie van twee bacteriële stammen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen.
- Live-cell imaging en time-lapse imaging op rechtopstaande of omgekeerde epifluorescentiemicroscopen.
- Kwantitatieve beeldanalyse met FIJI (ImageJ), inclusief thresholding, binaire maskering en particle-analyse om het totale celoppervlak te meten.
Belangrijkste resultaten
- Geconcentreerde gemengde culturen bevorderden het cel-celcontact, wat resulteerde in inhibitie (afronding of verdwijning) van de doelcellen door de inhibitorstam.
- Gedispergeerde culturen zonder voldoende contact vertoonden geen inhibitie van de doelstam.
- T6SS-mutante stammen inhibeerden de doelcellen niet, wat de rol van contactafhankelijke mechanismen bevestigt.
- Kwantitatieve analyse toonde een netto afname van het doeloppervlak en een netto toename van het inhibitoroppervlak onder effectieve competitieomstandigheden.
Conclusies
- Het beschreven protocol maakt een reproduceerbare kwantificering van interbacteriële competitie op single-cell niveau mogelijk.
- Het gebruik van het totale celoppervlak als metriek vereenvoudigt de analyse en vergroot de toegankelijkheid.
- De methode is aanpasbaar voor diverse bacteriële systemen en kan worden geoptimaliseerd voor verschillende groei- en beeldvormingscondities.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve fluorescentie-imaging op single-cell niveau van interbacteriële competitie maakt nauwkeurige analyse mogelijk van microbiële interacties die de structuur en functie van het microbioom vormgeven. Deze aanpak biedt reproduceerbare, toegankelijke metingen van competitieve dynamiek, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en targetvalidatie bij microbiome-gerichte ontdekkingen. De aanpasbaarheid van de methode en de kwantitatieve resultaten maken het tot een herbruikbare capaciteit voor vroege R&D en translationeel microbiome-onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie en kwantificering van contactafhankelijk bacterieel antagonisme op single-cell resolutie mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van microbiële effectoren, zoals het type VI secretiesysteem, in competitieve contexten.
- Vergemakkelijkt mechanistische risicoreductie door onderscheid te maken tussen contactafhankelijke en contactonafhankelijke effecten.
- Biedt kwantitatieve metrieken voor hypothese-gestuurd onderzoek naar microbiële interacties.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare imaging-workflows voor het evalueren van competitieve fenotypes over verschillende bacteriële stammen heen.
- Genereert kwantitatieve, op oppervlakte gebaseerde resultaten die geschikt zijn voor comparatieve analyse en downstream screening.
- Maakt opschaalbaarheid van de assay en hergebruik van het platform mogelijk voor diverse kweekbare isolaten en microbioommodellen.
- Ondersteunt de robuuste evaluatie van kandidaatstammen of effectoren in competitieve omgevingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante microbioommodellen door kwantificering van interbacteriële dynamiek mogelijk te maken.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van microbiële interventies.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van therapeutica gericht op het microbioom op basis van kwantitatieve competitiegegevens.
- Faciliteert de ontwikkeling van translationele biomarkers door competitieve resultaten te koppelen aan functionele read-outs.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit fluorescentie-imagingprotocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek voor microbiome-gerichte R&D en ondersteunt zowel hypothesetests als kwantitatieve screening.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert competitieve interacties om microbiële pathways te verduidelijken en effectorfuncties te valideren.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve oppervlaktemetingen voor een robuuste vergelijking van stamfenotypen.
- Analytica: Maakt statistische analyse van competitieve resultaten mogelijk met behulp van opensource tools voor beeldanalyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische studies door ziekte-relevante competitie-assays te ondersteunen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Het aanpasbare protocol ondersteunt brede toepassing binnen diverse microbiome-onderzoeksportefeuilles.
Operationele en bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van microbiële targets en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Standardiseert imaging- en analyseworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen en vermindert het biologische risico in therapeutische pipelines voor het microbioom.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van microbiële targets en interventies mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Toegang tot rechtopstaande of geïnverteerde epifluorescentiemicroscopen en open-source analysesoftware (FIJI/ImageJ) is noodzakelijk.
- Standaardisatie van objectglaspreparatie en beeldvormingsparameters over teams heen is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse kweekbare bacteriële systemen, met protocoloptimalisatie voor groeicondities en beeldvormingscondities.
- Afhankelijk van een hoogwaardige preparatie van agarosepads en een zorgvuldige experimentele opzet voor optimale beeldvorming.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Agarose Pad Preparation
1:47
Co-Incubation Strain Preparation
2:37
Bacterial Strains Coincubation
3:35
Slide Setup
4:17
Fluorescence Microscopy
4:46
Image Analysis
5:50
Results: Fluorescence Image Analysis to Assess Target Strain Inhibition in Coincubation Assay
7:08
Conclusion
