Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Een robuuste plaatlezertest zoals de onze is zeer nuttig voor de eerste screening van potentiële methyltransferaseremmers. De mogelijkheid om gegevens in realtime te verzamelen is een groot voordeel van de continue endonuclease-gekoppelde test. Begin met het bereiden van 600 microliter van de testomstandigheden die 20 micromolaire en 50 micromolaire verbindingen afzonderlijk bevatten in de microcentrifugebuizen op ijs.

Voeg hiervoor dubbel gedestilleerd water en 5X methylatiebuffer toe aan elke buis om een uiteindelijke concentratie van 1X methylatiebuffer te bereiken. Voeg vervolgens 3,15 microliter 20 milligram per milliliter runderserumalbumine of BSA toe aan elk monster. Voeg vervolgens twee microliter 3,15 micromolair haarspeld DNA-substraat en 1,33 microliter 4,75 micromolair S-adenosylmethionine of SAM toe aan elk monster.

Voeg de remmer toe aan de juiste monsters om een eindconcentratie van 21 micromolair of 52,5 micromolair en een equivalente hoeveelheid dimethylsulfoxide of DMSO aan een controlemonster te bereiken voordat de oplossingen gedurende drie seconden met 3.000 omwentelingen per minuut worden gemengd. Draai vervolgens de monsters gedurende een paar seconden in een tafeltafel minicentrifuge op 1, 200 maal G om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld. Aliquot 95 microliter van elke testoplossing in zes opeenvolgende putten in een zwart half gebied 96 putplaat.

Bereid 75 microliter Gla I of DNMT1 plus Gla I enzymoplossing in de microcentrifugebuizen zoals eerder beschreven tot een uiteindelijke concentratie van eenmalige buffer. Voeg vervolgens 1,2 microliter van 10 eenheden per microliter Gla I toe aan elke oplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,16 eenheden per microliter te bereiken. Voeg 0,6 microliter van vijf micromolaire RFTS-ontbrekende DNMT1 toe aan de DNMT1 plus Gla I-oplossing voor een eindconcentratie van 40 nanomolair.

Na voorzichtig mengen, draai de monsters gedurende enkele seconden in een tafelblad minicentrifuge op 1.200 G om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld. Vervolgens aliquot 12 microliter van elke enzymoplossing in zes putten in een conisch bodemplaatje van 96 putten. Voor de methylatietest van het DNA-monster verwarmt u de plaatlezer voor op 37 graden Celsius.

Plaats vervolgens de zwarte plaat met de testoplossingen in de plaatlezer. Na het schudden van de plaat op 425 CPM, meet de fluorescentie met een excitatiegolflengte van 485 nanometer en een emissiegolflengte van 528 nanometer. Incubeer vervolgens de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Verwijder de testplaat uit de plaatlezer en voeg vijf microliter van de enzymoplossing toe aan elke put, gevolgd door de oplossing te mengen door op en neer te pipetteren. Steek de plaat in de plaatlezer en schud de plaat voordat u de fluorescentie elke 53 seconden gedurende 30 minuten opneemt. Verkrijg de gemiddelde fluorescentie van de drievoudige Gla I-controletests voor elke aandoening en trek de gemiddelde Gla I-met controlereactietrays af van de drievoudige sporen die zijn verkregen in aanwezigheid van RFTS-ontbrekende DNMT1.

Bepaal vervolgens de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor de gecorrigeerde replicaties. Plot het gemiddelde gecorrigeerde reactiespoor en pas het initiële lineaire gedeelte aan op een lijn om de beginsnelheid te bepalen. Bepaal het percentage activiteit door de snelheid waargenomen in de aanwezigheid van een verbinding te delen door de snelheid waargenomen in de DMSO die controlereactie bevat en te vermenigvuldigen met 100.

De resultaten van een discontinue endonuclease-gekoppelde test toonden aan dat volledig gemethyleerd product-DNA wordt beschermd tegen splitsing, wat bevestigt dat RFTS-ontbrekende DNMT1 actief is en in staat is om het gehemimethyleerde substraat-DNA te methyleren. In de op fluorescentie gebaseerde test had, bij afwezigheid van Gla I, de toevoeging van DNMT1 of buffer alleen geen invloed op de achtergrondfluorescentie. Latere toevoeging van Gla I aan alle assays resulteerde in fluorescentiegeneratie alleen in assays die DNMT1 bevatten.

De gelijktijdige toevoeging van RFTS-ontbrekende DNMT1 en Gla I aan drie assays resulteerde in robuuste fluorescentiegeneratie. De toevoeging van Gla I alleen produceerde geen fluorescentie. Om te screenen op potentiële remmers, werd de DNA-methylatieactiviteit van RFTS-ontbrekende DNMT1 onderzocht in aanwezigheid van DMSO, verbinding één, verbinding twee of verbinding drie bij 20 en 50 micromolaire concentraties.

De verbindingen die de fluorescentiegeneratie in deze gekoppelde test verminderen, moeten verder worden gevalideerd. Ervoor zorgen dat de verbindingen het koppelende enzym niet remmen, is een belangrijke volgende stap.