Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

Dit protocol beschrijft methoden waarmee onderzoekers CDNA's of SIRNA's kunnen uitdrukken in het inheemse blaasurotheel. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de relatieve eenvoud, het vermogen om cDNA's, siRNA's in het urotheel met hoge efficiëntie en binnen een relatief korte tijd tot expressie te brengen. Het moeilijkste deel van deze techniek is de katheterisatie.

De algehele techniek is echter relatief gemakkelijk onder de knie te krijgen als je het eenmaal hebt geleerd. Giovanni Ruiz, een Research Specialist IV in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen plaats je de verdoofde muis op een verwarmingskussen naast de neuskegels.

Houd het dier onder narcose voor de duur van het protocol. Controleer of de muis volledig verdoofd is met een teenknijper. Om te voorkomen dat er lucht in de blaas wordt gebracht, vult u het plastic kathetergedeelte van een infuuskatheter en de bijbehorende naaf met steriele PBS met behulp van een steriele transferpipet of spuit.

Met het dier in rugligging swabt de uitwendige urethrale meatus met 70% alcohol. Pak vervolgens voorzichtig het weefsel dat de externe urethrale meatus vormt en strek het verticaal weg van het dier met een fijne tang. Breng de steriele katheter in de uitwendige meatus in.

Breng met de andere hand de katheter voorzichtig verticaal ongeveer drie tot vier millimeter in de urethrale meatus in. Laat vervolgens de katheter die in de uitwendige meatus is ingebracht in de richting van de staart van het dier zakken, waardoor het gemakkelijker wordt om binnen te komen in het deel van de urethra dat onder het schaambeen en uiteindelijk in de blaas passeert. Laat de urine in de blaas uitlekken.

Verwijder eventuele resterende urine door Crede's manoeuvre uit te voeren door te masseren en zachtjes op de blaasbult in de onderbuik te drukken. Om het urotheel ontvankelijk te maken voor transductie, wast u de blaas van de muis of rat door een steriele spuit van één milliliter gevuld met PBS aan de katheterhub te bevestigen. Injecteer 100 microliter steriel PBS in de muizenblaas.

Nadat u de spuit van de katheterfitting hebt losgemaakt, laat u de PBS leeglopen. Inbreng 100 microliter 0,1% N-dodecyl-bèta-D-maltoside opgelost in PBS en 0,2 micrometer filter gesteriliseerd in de muizenblaas met behulp van een steriele spuit van één milliliter. Houd de N-dodecyl-beta-D-maltoside gedurende 10 minuten in de blaas door de spuit op zijn plaats te laten.

Verwijder de N-dodecyl-beta-D-maltoside uit de blaas door de spuit los te maken en uit te laten lopen. Om het virus in de blaas te introduceren, bevestigt u een steriele spuit van één milliliter aan de katheterhub en brengt u 5.000.000.000 tot 100.000.000 IVP adenovirus verdund in 100 microliter steriel PBS voor muizen of 450 microliter voor ratten in de blaas. Maak na 30 minuten de spuit los en laat de virusoplossing de blaas evacueren op een wegwerppad.

Dep eventuele resterende virusoplossing met een absorberend doekje terwijl u het maandverband weggooit en veeg het biologisch gevaarlijk afval eraf. Om het dier te laten herstellen, stopt u de stroom isofluraan. Laat het dier herstellen en volledig mobiel zijn voordat u het terugbrengt naar zijn kooi, vooral als de dieren in groepshuisvesting zijn.

Analyseer de effecten van transgenexpressie 12 tot 72 uur na de behandeling met behulp van methoden zoals mRNA in situ hybridisatie, Western blot of immunofluorescentie. Western blot-analyse van urotheliale lysaten onthulde V5-gelabelde menselijke groeihormoonexpressie in het urotheel van getransduceerde blazen, maar niet in niet-getransduceerde blazen. De expressie werd ook bevestigd door immunofluorescentie met behulp van antilichamen die menselijk groeihormoon herkenden, of de V5-epitooptag.

Western blot-analyse bevestigde de expressie van Claudin-2 bij ratten getransduceerd met adenovirus, maar niet bij ratten getransduceerd met een gecontroleerd GFP-coderend virus. Immunofluorescentieanalyse bevestigde verder exogene Claudin-2-expressie in urotheliale paraplucellen getransduceerd met viruscoderend Claudin-2 cDNA. Detectie van exogene Claudin-2 in Tight Junction Protein 1 door immunofluorescentie en confocale microscopie van geheel gemonteerd of dwarsdoorsnedend urotheel onthulde de aanwezigheid van Tight Junction en intracellulaire accumulaties van Claudin-2 in het celcytoplasma.

Het beeldveld laat zien dat het tellen van het aantal getransduceerde paraplucellen een efficiëntie onthult die 95% benadert en in het geheel van de blaaswand wordt alleen het urotheel getransduceerd en geen ander weefsel wordt aangevallen door het ingebrachte adenovirus. De katheterisatie is van cruciaal belang om het protocol te laten werken zoals bedoeld. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om de normale urotheliale biologie te bestuderen, evenals om omstandigheden te begrijpen waarin eiwitoverexpressie of onderexpressie tot ziekte leidt.