3-D Time-Lapse Beeldvorming van celwanddynamica met behulp van calcofluor in de Moss Physcomitrium patens

Time-lapse beeldvorming met fluorescentiemicroscopie maakt observatie van de dynamische veranderingen van groei en ontwikkeling op cellulair en subcellulair niveau mogelijk. Dit eenvoudige protocol voor 3D time-lapse beeldvorming kan de celwanddynamiek over een lange periode direct bestuderen. Dit protocol maakt gebruik van calcofluorkleurstof om de dynamiek van de celwanddikte te markeren en vereist daarom geen transformatie van een fluorescerend eiwit.

De calcofluorsignalen zijn stabiel en kunnen langer dan een week aanhouden. Deze methode kan worden toegepast op veel andere systemen met eenvoudige structuren die celwanden bevatten en kan worden gekleurd door calcofluor zoals in bloeiende planten. In dit protocol zijn de calcofluorsignalen stabiel wanneer deze kleurstof in het medium wordt gemengd tijdens het hele proces van time-lapse beeldvorming.

Verspreid om te beginnen het zeven dagen oude mosweefsel in een microbuis van 1,5 milliliter met 20 microliter gesteriliseerd water. Gebruik voor het wilde type een tang om de protonemata te scheiden. Voor de ggb-mutant scheidt u de protonemata met behulp van de AP-1000-pipet.

Voeg 10 microliter van de gesteriliseerde calcofluor-white toe aan de microbuis en laat de buis twee minuten rechtop in de kap staan voor kleuring. Meng de planten onmiddellijk na het kleuren met 200 microliter gekoeld BCDATG met BCDAT-medium door vijf keer te pipetteren met een P1000-pipet en breng het mengsel over in een 27 millimeter glazen basisschaal. Zorg ervoor dat de 200 microliter BCDATG met monsters gelijkmatig wordt verdeeld over het oppervlak van de 27 millimeter glazen bodemschaal om een dunne laag film te produceren, zodat de monsters zich tijdens het beeld binnen de objectieve werkafstand bevinden.

Na twee minuten stollen bij kamertemperatuur, dek je de dunne laag af met drie milliliter afgekoeld BCDATG en laat je hem 10 minuten opstijven om weer te stollen. Teken aan de onderkant van de schotel negen lijnen elk in parallelle en loodrechte richtingen en markeer de rijen met tekens van A tot H en de kolommen met cijfers van één tot acht. Gebruik boven, onder, rechts, midden en links om de posities binnen elk vierkant te markeren.

Als een plant zich bijvoorbeeld in een vierkant in de tweede rij bevindt, in de zesde kolom en zich in de linkerbovenhoek van het vierkant bevindt, krijgt deze plant de naam b6 linksboven. Plaats de glazen bodemschaal één tot twee dagen onder wit licht voordat u elke dag wordt onderworpen aan time-lapse-beeldvorming, gedurende maximaal drie dagen. Als u de 3D-afbeeldingen wilt reconstrueren, opent u het ND2-bestand en klikt u op Volume.

Reconstrueer de celwand op dag nul, dag één, dag drie en dag vier. Nadat je elke afbeelding hebt gemaakt, plaats je de schaal op basis van glas terug in de kweekkamer. Dynamische veranderingen in dwarswanden werden aangetoond door calcofluor-witte kleuring in wildtype en ggb-mutanten.

Voor ggb-mutanten geven witte stippellijnen onder elke afbeelding de gebroken oppervlaktecelwand in de uitzettende cellen aan en oranje lijnen geven de cellen onder het celwandoppervlak aan in ggb. De verschillen in calcofluor-wit signaal kunnen worden gedetecteerd op de oppervlakteposities van de cellen en minder dicht bevlekte gebieden die wijzen op celexpansie in ggb-mutanten of nieuw vertakkende locaties in het wilde type. Voor wild type precultuur zijn de planten in zwak rood licht van het bovenstaande gedurende vijf dagen nodig om de fototrope reacties van protonemata te induceren, zodat de planten aan de bodem van gerechten kunnen worden bevestigd en de planten tijdens de beeldvorming binnen de objectieve upworking-afstand kunnen worden tevoorschijn kunnen komen, omdat calcofluor-wit kan worden gebruikt met andere kleurstoffen zoals microsfeer.

Aanvullende informatie over de celexpansie kan ook worden bestudeerd. Dynamiek van de celwand van planten is van cruciaal belang voor een efficiënte groei en ontwikkeling en voor de reactie op omgevingssignalen. Dit protocol maakt directe van de verdeling van veranderingen in celwandsignalen en integratie mogelijk.