Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën
25 september 2023
We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.
Bij bacteriën vereist de studie van de dynamiek van celdelingseiwitten een ruimtelijke oriëntatie van de cellen. In het geval van de Z-ring, het hoofdbestanddeel van bacteriële celdeling, is een verticale oriëntatie bijvoorbeeld fundamenteel om de hele structuur in het XY-vlak vast te leggen. In deze video ontwikkelen we een methode om deze specifieke oriëntatie te bereiken in de filamenteuze cyanobacteriën Anabaena.
Anabaena is een meercellig fotosynthetisch organisme en deelt met andere bacteriën het vermogen om atmosferische dinitrogen als stikstofbron te gebruiken. Bij afwezigheid van dit element differentiëren Anabaena cellen die gespecialiseerd zijn in stikstoffixatie. Daarom biedt het een uitstekend model om de relatie tussen cellulaire deling en meercelligheid te analyseren.
Selecteer eerst een divisoomcomponent die aanwezig is in de doelfilamenteuze cyanobacteriestam. Voor het experiment is het noodzakelijk om een filamenteuze cyanobacteriële mutant te construeren die de geselecteerde divisoomcomponent tot expressie brengt die is gefuseerd met een fluorescerend eiwit. In dit protocol gebruiken we een Anabaena-mutant die FtsZ uitdrukt gefuseerd met GFP als voorbeeld.
Maak eerst een nieuwe subcultuur van de mutant met 10 milliliter van een cultuur in stationaire fase en 90 milliliter vloeibaar medium. Laat vervolgens de nieuwe celcultuur groeien in constant licht en bij de optimale temperatuur, totdat de exponentiële fase wordt bereikt. In ons voorbeeld werd de mutant zeven dagen lang gekweekt bij 25 graden Celsius.
Neem nu twee milliliter van de groeicultuur en doe deze in een centrifugebuis. Centrifugeer op 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Controleer na de centrifugatie of alle cellen zich op de bodem van de buis bevinden.
Wees voorzichtig bij het hanteren van de monsters om te voorkomen dat u opnieuw suspensie gebruikt. Verwarm de agarose-oplossing met een laag smeltpunt in een magnetron. Het is belangrijk om dit in korte tijdsintervallen te doen en de oplossing te controleren totdat deze volledig vloeibaar is.
Zodra het is gesmolten, zet het opzij om af te koelen. Neem de centrifugebuizen van de vorige stap, gooi 1,9 milliliter van het supernatant weg en suspensie de cellen opnieuw in het resterende volume door minstens drie keer op en neer te pipetteren. Plaats op uw werkplek de buis met de cellen, de gesmolten agarose-oplossing, een spuit van één milliliter in de punt gesneden en een scalpel met een nieuw en schoon mes.
Meng vervolgens de cellen met 900 microliter van de 3% agarose-oplossing door minstens drie keer te pipetteren. Het is echt belangrijk om ervoor te zorgen dat de agarose-oplossing niet te heet is, maar vloeibaar blijft. Hiermee voorkomen we celschade tijdens dit proces.
De volgende stap moet snel worden gedaan en voordat de agarose-oplossing gelifieert. Zuig de agarosematrix voorzichtig op in een spuit van één milliliter. Het is belangrijk om het genereren van bubbels te voorkomen terwijl het monster wordt opgezogen.
Incubeer daarna het monster en plaats de spuit gedurende twee uur in horizontale positie bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie voorzichtig de matrix met de cellen met behulp van de zuiger in een schoon en vlak oppervlak. Snijd het gelmonster met behulp van het scalpel in plakjes zo dun mogelijk, waarbij de integriteit van de matrix behouden blijft.
Deponeer vervolgens de monsters in de bijbehorende coverslip, naast elkaar. Zoals te zien is in de video, kunt u in deze stap een tip gebruiken om te helpen bij het verwerkingsproces van het monster. Voor time-lapse-experimenten wordt het gebruik van een celkamer voor microscopie-analyse aanbevolen.
In dit geval gebruiken we ronde coverslips die in dit soort kamers passen, zoals je in de video kunt zien. Ten slotte, om uitdroging van het monster te voorkomen, voegt u een extra volume gesmolten 3% agarose-oplossing toe in de kamer. Wacht voor de beeldvorming tot de agarose volledig gelated is.
Plaats nu de kamer met de cellen in de microscoop voor beeldvorming. Het is aan te raden om een apparaat te gebruiken met temperatuur- en vochtigheidsregeling. Visualiseer het monster in een helder veld met maximale vergroting en zoek een verticaal georiënteerde gloeidraad.
U kunt de divisiesite van belang vinden met een eerste scan met behulp van het autofluorescentiesignaal langs het Z-vlak. Gebruik hiermee de parameters van uw fluorescerende eiwitmarker om het signaal van uw eiwit van belang in de delingsplaats te visualiseren. Nu kunt u time-lapse-experimenten uitvoeren volgens het biologische model en het eiwit van belang.
In dit geval kunnen we de hele structuur van de Z-ring zien in de FtsZ-GFP-mutant, in het XY-vlak. Met onze methode waren we in staat om de dynamiek van deze ringen in een lange periode vast te leggen. Ten slotte concluderen we met de veranderingen in fluorescentie-intensiteit dat deze structuur zeer dynamisch is in ons model.
Deze methode is een snel en goedkoop protocol om de eiwitdynamica in de delingsplaats te registreren door middel van confocale microscopie toegepast op complexe morfologieën als filamenteuze cyanobacteriën, met Anabaena als model.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een innovatieve methode voor het visualiseren van filamenteuze cyanobacteriën in een verticale oriëntatie, waardoor gedetailleerde observatie van celdelingsproteïnen, in het bijzonder de Z-ringstructuur, mogelijk wordt. Met behulp van de cyanobacterie Anabaena als model demonstreert de methode hoe fluorescerende markers effectief kunnen worden toegepast om de dynamiek in complexe multicellular vormen te bestuderen.
Belangrijke componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celdeling
- Cyanobacteriële biologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Anabaena zijn meercellige fotosynthetische organismen die in staat zijn tot stikstoffixatie.
- Inzicht in de proteïnedynamiek in cyanobacteriën kan bijdragen aan kennis over celdeling en meercelligheid.
- Een ruimtelijke oriëntatie bij beeldvorming is essentieel voor het vastleggen van complete structuren zoals de Z-ring.
Gebruikte methoden
- Fluorescerend eiwit-tagging van de divisoom-component FtsZ
- Filamenteuze cyanobacteriën model-systeem (Anabaena)
- Confocale microscopie voor beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- De dynamiek van de Z-ringstructuur werd succesvol gevisualiseerd in het XY-vlak.
- De methode vertoonde een hoge temporele resolutie en maakte continue observatie van het eiwitgedrag mogelijk.
- De resultaten bevestigden de dynamische aard van de Z-ring tijdens de celdeling.
Conclusies
- Deze methode vergemakkelijkt de studie van proteïnedynamiek in filamenteuze organismen en biedt een kader dat toepasbaar is op diverse filamenteuze soorten.
- De bevindingen dragen bij aan een breder begrip van de celbiologie en microscopiemethodologieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Hoge-resolutie time-lapse imaging van proteïnedynamiek in complexe bacteriële systemen is cruciaal voor het verminderen van risico's in vroege ontdekkingsfasen en voor het valideren van targets die gerelateerd zijn aan de celdeling. De methode van verticale immobilisatie voor filamenteuze cyanobacteriën maakt directe visualisatie van de assemblage en dynamiek van de Z-ring mogelijk, wat het voorspellende vertrouwen in mechanistische studies ondersteunt. Deze mogelijkheid versterkt de translationele brug van basiscelbiologie naar toegepaste microbiële engineering en synthetische biologieportfolio's.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de dynamiek van celdelingsproteïnen in multicellulare bacteriële modellen mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de vorming en het gedrag van de FtsZ Z-ring in vivo te visualiseren.
- Faciliteert functionele validatie van deling-gerelateerde targets in genetisch gemodificeerde stammen.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, verticaal georiënteerde biologische monsters voor voor kwantitatieve imaging-workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door de monsteroriëntatie en imaging-condities te standaardiseren.
- Maakt robuuste time-lapse readouts mogelijk voor het screenen van divisie-modulerende verbindingen in complexe morfologieën.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt imagingresultaten uit met ziekterelateerde of industrieel relevante multicellulaire bacteriële systemen.
- Zorgt voor continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische toepassingen van microbiële engineering.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde ontwikkeling van engineered stammen voor biotechnologisch gebruik.
Pipeline- & workflowintegratie
Dit protocol voor verticale immobilisatie sluit aan bij de overgang tussen vroege ontdekking en assayontwikkeling, wat high-content imaging mogelijk maakt van doelwitvalidatie tot evaluatie in preklinische microbiële modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot de functie van delingsproteïnen en de ruimtelijke organisatie in multicellular bacteriën.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare monstervoorbereiding voor kwantitatieve imaging-assays.
- Analytiek: Biedt tijdopgeloste, kwantitatieve fluorescentiemetingen van proteïnedynamiek bij delingsplaatsen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten en preklinische microbiële engineering en workflows voor synthetische biologie.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Biedt een schaalbare, kosteneffectieve methode die aanpasbaar is aan diverse filamenteuze bacteriesystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de functie van delingsproteïnen en de validatie van targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende projecten heen.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk voor initiatieven op het gebied van microbiële engineering en synthetische biologie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van interventies gericht op deling en van engineered stammen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en fluorescent eiwitengineering.
- Toegang tot temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde imaging-platforms is noodzakelijk.
- Standaardisatie van monstervoorbereiding en imaging-protocollen over teams heen is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse filamenteuze bacteriële modellen met passende genetische tools.
- De oriëntatie en hantering van monsters zijn cruciaal voor reproduceerbare, high-content imaging-resultaten.
