Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie
10 november 2023
De toepassing van steunlagen op cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters kan de deeltjesdichtheid verhogen, interacties met de lucht-waterinterface beperken, door bundels geïnduceerde beweging verminderen en de verdeling van deeltjesoriëntaties verbeteren. Dit artikel beschrijft een robuust protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen voor een betere voorbereiding van cryomonsters.
Een veel voorkomende uitdaging bij de voorbereiding van cryo-elektronenmicroscopiemonsters is de lokalisatie van deeltjes op het grensvlak tussen lucht en water, waardoor de deeltjes voorkeursoriëntaties aannemen en denatureren. In plaats daarvan is het beter om de deeltjes op het roosteroppervlak te laten rusten, wat dunne film ondersteunt, zoals grafeen bevorderen. Een andere uitdaging is de eis van relatief hoge monsterconcentraties, die ook door grafeen kunnen worden aangepakt.
Met grafeen gecoate roosters bieden tal van voordelen voor de bepaling van de cryoEM-structuur, maar zijn van oudsher moeilijk om in eigen huis reproduceerbaar te fabriceren, evenals de kosten om commercieel aan te schaffen. Dit protocol maakt de robuuste afzetting van monolaags grafeen mogelijk, waardoor de drempel voor gebruikers om deze rasters in hun onderzoek te gebruiken, wordt verlaagd. Grafeen is uniek vanwege zijn materiaaleigenschappen.
Het is een monolaag van koolstof en vertoont daardoor minimale achtergrondruis. Andere cryoEM-rasterondersteuningen, zoals een dunne laag amorfe koolstof- of grafeenoxidevlokken, kunnen niet als een enkele monolaag worden aangebracht en dragen meer achtergrondsignaal bij. Nu we een robuust protocol hebben opgesteld voor de toepassing van grafeen op cryoEM-roosters, willen we de functionalisering van met grafeen gecoate roosters voortzetten met affiniteitshandvatten voor on-grid afvang rechtstreeks uit cellysaten.
Dit zou een ander knelpunt in de voorbereiding van cryoEM-monsters kunnen verlichten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het coaten van cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters met een monolagen grafeen. Het gebruik van grafeen verhoogt de partikeldichtheid, minimaliseert interacties met de lucht-waterinterface en verbetert de distributie van de partikeloriëntatie.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Cryogene elektronenmicroscopie
- Materiaalkunde
- Monstervoorbereidingstechnieken
Achtergrond
- De lokalisatie van deeltjes aan het lucht-watergrensvlak is een veelvoorkomende uitdaging bij cryo-EM.
- Voorkeursoriëntaties kunnen leiden tot denaturatie van deeltjes.
- Grafeenondersteuningen kunnen helpen om deeltjes op het grid-oppervlak te laten rusten.
- Historisch gezien waren grafeen-gecoate grids moeilijk en kostbaar om te vervaardigen.
Doel van de studie
- Om een robuust protocol te bieden voor de depositie van monolaag grafeen op cryo-EM-roosters.
- Om de drempels voor onderzoekers om grafeen-gecoate roosters te gebruiken te verlagen.
- Om de voordelen van cryo-EM-structuurbepaling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een protocol voor grafeencoating.
- Evaluatie van de partikeldichtheid en oriëntatie.
- Vergelijking van grafeen-gecoate grids met traditionele grids.
- Beoordeling van de reproduceerbaarheid bij de fabricage van grids.
Belangrijkste resultaten
- Met grafeen gecoate grids verbeteren de lokalisatie van deeltjes aanzienlijk.
- Een verhoogde deeltjesdichtheid maakt een betere structuurbepaling mogelijk.
- Een robuust protocol vergemakkelijkt de eigen productie van grafeengrids.
- Lagere kosten en verbeterde toegankelijkheid voor onderzoekers.
Conclusies
- Het gebruik van grafeen in cryo-EM-roosters pakt belangrijke uitdagingen bij de monsterpreparatie aan.
- Dit protocol maakt een bredere adoptie van grafeen-gecoate roosters in onderzoek mogelijk.
- De unieke eigenschappen van grafeen verbeteren de cryo-EM-mogelijkheden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Knelpunten bij de monstervoorbereiding in cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) beperken de doorvoersnelheid en betrouwbaarheid van hoogresolutie structurele bepaling in vroege discovery- en structurele biologiepijplijnen. De toepassing van monolagen grafeen op cryoEM-roosters pakt kritieke uitdagingen aan met betrekking tot de lokalisatie van partikels, oriëntatiebias en vereisten voor monsterconcentratie, wat een directe impact heeft op de voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie en mechanistische studies. Robuuste, reproduceerbare protocollen voor grafeenroosters maken een bredere adoptie binnen organisaties mogelijk, wat risico-gecorrigeerde portfolio-ontwikkeling en een efficiënte toewijzing van middelen ondersteunt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt hoogwaardige structurele analyse van macromoleculaire targets mogelijk met een bijna-atomaire resolutie.
- Vermindert denaturatie van monsters en oriëntatiebias, wat bijdraagt aan het mechanistisch minimaliseren van risico's.
- Faciliteert betrouwbare targetvalidatie door de partikeldichtheid en beeldconsistentie te verbeteren.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gestandaardiseerde, reproduceerbare grid-ondersteuning voor voor downstream cryoEM-workflows.
- Verbetert de betrouwbaarheid van assays door achtergrondruis te minimaliseren en kwantitatieve imaging-outputs te optimaliseren.
- Ondersteunt schaalbare screening van structureel diverse complexen bij lagere monsterconcentraties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt structurele studies van ziekterelateerde complexen mogelijk, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers.
- Biedt continuïteit van structuuroplegging in de ontdekkingsfase tot preklinische validatie van moleculaire mechanismen.
- Vermindert het risico op biologisch falen in een laat stadium door de kwaliteit van de structurele gegevens te waarborgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De bereiding van monolayer-grafeengitters is geïntegreerd in de cryo-EM-workflow, van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van hypothesegestuurde structuurbepaling en mechanistisch inzicht.
- Discovery Biology: Ondersteunt robuuste toetsing van de nulhypothese door nauwkeurige structurele vergelijkingen tussen verschillende condities mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare grids met een lage achtergrond voor kwantitatieve beeldvorming en standaardisatie van assays.
- Analytics: Levert diffractiepatronen en dichtheidskaarten van hoge kwaliteit voor statistische analyse en besluitvorming.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft de continuïteit van structurele gegevens voor ziekterelateerde targets en complexen.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een schaalbare, reproduceerbare capaciteit voor grid-preparatie voor diverse R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in structurele studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert de rastervoorbereiding, verbetert de reproduceerbaarheid en verlaagt de vereisten voor monsterinput.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en de kapitaalefficiëntie door knelpunten in de monstervoorbereiding te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van structureel gevalideerde targets mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van grafeen en de preparatie van cryo-EM grids.
- Toegang tot spincoaters, glow-discharge units en UV-ozonreinigers is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende macromoleculaire systemen of monstertypes.
- Praktische beperkingen omvatten de kwetsbaarheid bij hantering en het waarborgen van de integriteit van de monolaag tijdens de overdracht.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
