Point-of-care diagnostiek op basis van CRISPR met voorgemengde en gevriesdroogde reagentia
16 augustus 2024
Hier presenteren we de stapsgewijze voorbereiding van voorgemengde, gevriesdroogde recombinase-gebaseerde isotherme amplificatie en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)-gebaseerde reacties, die kunnen worden gebruikt voor de detectie van nucleïnezuurbiomarkers van infectieziekteverwekkers of andere genetische markers van belang.
We ontwikkelen point-of-care-tests om dit materiaal van infectieziekten op te sporen. Deze test maakt gebruik van isotherme nucleïnezuuramplificatie en op CRISPR gebaseerde detectie. Met een zeer osmotische nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met PCR, kunnen ze kleine sequentieverschillen detecteren, waaronder enkelvoudig nucleotidepolymorfisme, en kunnen ze veelvouden zijn.
CRISPR, de osmotische reacties bevatten meerdere componenten en stappen en zijn moeilijk uit te voeren op het zorgpunt. Omdat ze op CRISPR zijn gebaseerd, zijn de osmotica zeer gevoelig, er bestaat een risico op overdrachtsbesmetting die tot valse resultaten kan leiden. Gelukkig kan dit probleem worden verholpen als we de procedures van de reacties vereenvoudigen.
We bieden een eenvoudig te gebruiken methode om onze ziekteverwekkers en genetische markers te detecteren met behulp van recombinase, isothermische amplificatie en op CRISPR gebaseerde reagentia. Deze reagentia zijn eenvoudig op te slaan en te gebruiken. We bieden ook tips om veelvoorkomende problemen bij het gebruik van deze methoden en reagentia op te lossen, waardoor het voor mensen gemakkelijker wordt om ze te gebruiken.
Het protocol maakt hier gebruik van CRISPR-reagentia, die het transport en de opslag vergemakkelijken. De gevriesdroogde reagentia kunnen gemakkelijk worden gerehydrateerd op de punten van gebruik en behouden een hoge versterkings- en detectie-efficiëntie. We hopen CRISPR-diagnostische technologieën toe te passen om endemische en opkomende infectieziekten op te sporen.
Als deze test routinematig en correct kan worden uitgevoerd op het zorgpunt, kan dat de behandelingsopties voor antivirale en antibiotica informeren, mogelijk levens redden, overmatig gebruik van medicijnen en de ontwikkeling van resistentie verminderen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor de ontwikkeling van point-of-care-tests die gebruikmaken van isotherme nucleic acid amplificatie en CRISPR-gebaseerde detectie voor het identificeren van genetisch materiaal van infectieziekten. De benadering is erop gericht de gevoeligheid en nauwkeurigheid te verbeteren, terwijl uitdagingen zoals contaminatierisico's worden aangepakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Diagnostiek van infectieziekten
- Nucleïnezuuramplificatietechnieken
- CRISPR-technologie
Achtergrond
- Point-of-care-testen zijn essentieel voor de snelle diagnose van infectieziekten.
- Isotherme amplificatie maakt een efficiënte detectie van nucleïnezuren mogelijk.
- CRISPR-technologie biedt een hoge gevoeligheid voor de identificatie van genetisch materiaal.
- Contaminatierisico's kunnen leiden tot foutieve resultaten bij gevoelige assays.
Doel van de studie
- Om een vereenvoudigde procedure te ontwikkelen voor CRISPR-gebaseerde reacties.
- Om de nauwkeurigheid van het detecteren van kleine genetische variaties te verbeteren.
- Om contaminatierisico's in point-of-care-instellingen te beperken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van voorgemengde, gelyofiliseerde reagentia voor isotherme amplificatie.
- Implementatie van CRISPR-gebaseerde detectiemethoden.
- Evaluatie van de sensitiviteit en specificiteit bij het detecteren van nucleïnezuurbiomarkers.
- Optimalisatie van reactiecondities om contaminatierisico's te verminderen.
Belangrijkste resultaten
- De ontwikkelde methode vertoonde een hoge gevoeligheid voor het detecteren van genetische markers.
- Contaminatierisico's werden aanzienlijk verminderd door vereenvoudiging van de procedure.
- De resultaten waren vergelijkbaar met traditionele PCR-methoden.
- De aanpak is geschikt voor point-of-care-toepassingen.
Conclusies
- Deze studie presenteert een levensvatbare methode voor de snelle detectie van pathogenen van infectieziekten.
- CRISPR-gebaseerde assays kunnen effectief worden vereenvoudigd voor praktisch gebruik.
- Toekomstig werk kan zich richten op het verder verbeteren van de robuustheid van de tests.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Voorgemengde en gevriesdroogde CRISPR-gebaseerde diagnostische reagentia maken een snelle en nauwkeurige detectie van genetische markers van infectieziekten mogelijk bij de point-of-care, waardoor operationele knelpunten bij gedecentraliseerd testen worden weggenomen. Deze aanpak vermindert de complexiteit van handmatige handelingen en het risico op contaminatie, wat schaalbare implementatie in omgevingen met beperkte middelen en in het veld ondersteunt. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen voor vroegtijdige interventie en informeert de therapeutische besluitvorming in real-time.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt snelle analyse van genetische markers van pathogenen mogelijk voor targetvalidatie in onderzoek naar infectieziekten.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door hooggevoelige detectie van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen te bieden.
- Faciliteert portfolio-triage door onderscheid te maken tussen nauw verwante pathogenenstammen.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gebruiksklare, gevalideerde reagenssystemen voor gestroomlijnde workflows bij de ontwikkeling van assays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door het gebruik van vooraf gemengde, gelyofiliseerde formaten.
- Maakt schaalbare screening van klinische of milieu-monsters mogelijk met minimale instrumentatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door detectie van ziekterelevante nucleïnezuursignaturen mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van robuuste, in het veld inzetbare diagnostica.
- Vermindert het risico bij de verdere ontwikkeling van diagnostische kandidaten door de stabiliteit en efficiëntie van reagentia aan te tonen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert processen van vroege ontdekking tot translationeel onderzoek en ondersteunt workflows van targetidentificatie tot preklinische validatie van diagnostische platforms.
- Discovery Biology: Biedt betrouwbare detectie van genetische targets voor hypothesetoetsing en mechanistische studies.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve outputs voor het vergelijken van monstercondities en assay-prestaties.
- Analytics: Maakt gevoelige fluorescentie-gebaseerde readouts mogelijk voor robuuste data-analyse en besluitvormingsondersteuning.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen laboratorium- en veldtoepassingen en ondersteunt de ontwikkeling van biomarker-gestuurde diagnostiek.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar reagentia-platform dat aanpasbaar is aan diverse pathogeentargets en monstertypes.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de detectie van pathogenen.
- Operationele waarde: Vereenvoudigt workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt logistiek die onafhankelijk is van de koudeketen.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen voor diagnostische kandidaten en vermindert risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van diagnostische activa mogelijk voor opkomende en endemische ziekten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in nucleic acid-amplificatie en het ontwerp van CRISPR-gebaseerde assays.
- Toegang tot lyofilisatieapparatuur en fluorescentie-microplate-lezers is noodzakelijk voor de volledige uitvoering van de workflow.
- Standaardisatie van reagensbereiding en hanteerprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse monstertypen, maar optimalisatie voor specifieke pathogenen kan nodig zijn.
- Stabiliteit en efficiëntie zijn gedurende ten minste acht maanden bij -20°C gevalideerd, wat langdurige inzet ondersteunt.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
