ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza

Het algemene doel van het volgende experiment is om een nieuwe en snelle signaalversterkingsmethode te gebruiken voor het detecteren en karakteriseren van influenzavirale subtypes op de flu chip, een microarrayplatform met lage dichtheid. Dit wordt bereikt door gebiotineerde DTP's te incorporeren en primers met een fosforieleind aan het vijf-prime-uiteinde te gebruiken om het matrixgensegment en een niet-structureel gensegment uit influenza-RNA-extracten te amplificeren. De PCR wordt gevolgd door enzymatische digestie en fragmentatie om korte, enkelstrengse, gebiotineerde en geamplificeerde virale producten te genereren, die vervolgens na hybridisatie aan de array worden gebonden.

Fox-detectie maakt gebruik van fotopolymerisatie om grote polymeervlekken te laten groeien waar hybridisatie plaatsvindt, waarbij differentiële hybridisatiepatronen worden gebruikt om influenza-virussubtypes te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard fluorescentiedetectie, is dat het relatief goedkoop is en een snel resultaat geeft dat met het blote oog zichtbaar is, met een analytische sensitiviteit die vergelijkbaar is met die van fluorescentie. Deze methode kan inzicht bieden in de karakterisering van influenzavirussen met behulp van de flu-chip, omdat het een universele detectiemethode is.

Ampl Fox kan ook worden toegepast op een breed scala aan andere systemen, zoals andere DNA- en eiwitgebaseerde microarrays met een lage dichtheid. In theorie zou elk gebiotinyleerd product gedetecteerd moeten kunnen worden met behulp van amox. De procedure zal worden gedemonstreerd door Amber Taylor, associate scientist, en Kevin Moulton, research assistant hier bij Endeavor, die beiden de afgelopen jaren een centrale rol hebben gespeeld in de ontwikkeling van het Fox-instrument en de detectiechemie.

Extraheer viraal RNA uit 200 µL viraal isolaat met behulp van een viraal RNA-extractiekit en het protocol van de fabrikant. Elueer een eindvolume van 60 µL en bewaar de extracten bij -70 °C of lager voor later gebruik. Bereid vervolgens de RT-PCR-mastermix op ijs voor volgens het protocol van de fabrikant.

Voeg de flu chip primer-mix, die de getoonde concentraties bevat, toe aan de mastermix met behulp van een BIOTINYLATED DNTP-mengsel. Eén primer uit elke set moet een vijf-prime fosfaatgroep bevatten om enzymatische digestie te vergemakkelijken. De flu a primer-set produceert een product van 1032 baseparen, en de flu B primer-set produceert een product van 811 baseparen.

Vortex kortstondig en verdeel 18 µL mastermix over PCR-buisjes met dunne wand. Voeg vervolgens twee µL RNA-template toe aan elk reactiebuisje. Plaats de PCR-buisjes in een thermocycler en gebruik een cycluspictogram met een passende annealingtemperatuur.

Het gebruikte cyclingschema voor deze assay wordt hier getoond. Bereid het mengsel voor de enzymatische digestie door per PCR-reactie 2,2 µL enzymreactiebuffer, 0,8 µL nucleasevrij water en 1,0 µL lambda-exonucleasenzym te combineren. Haal de monsters uit de thermocycler en voeg vier µL van dit mengsel toe aan elke PCR-buis.

Plaats de monsters terug in de thermocycler en programmeer deze zoals getoond op 37 °C voor 15 minuten, gevolgd door 95 °C voor 10 minuten. Breng vervolgens eenmalig gebruikbare hybridisatiekuipjes aan rond de microarrays die gehybridiseerd moeten worden. Was de slides daarna in 110 ml gezuiverd water op een orbitale schudmachine gedurende vijf minuten.

Droog de objectglazen door voorzichtig met een tissue-doekje tegen de rand van de well te tikken. Meng 22 µL van een twee x hybridisatiebuffer met elk van de gefragmenteerde enkelstrengs DNA-producten, meng kort en pipetteer 40 µL in de microarray-wells. Laat de objectglazen gedurende één uur hybridiseren in een bevochtigingskamer; verwijder na de hybridisatie de objectglazen uit de bevochtigingskamer en spoel elk objectglas kort af met twee milliliter wasbuffer D. Plaats de objectglazen in een objectglashouder.

Voeg vervolgens 110 milliliters van wasbuffers A en B toe aan afzonderlijke containers met gebruik van een orbital shaker. Was het objectglazenrek in buffer A bij 60 tot 90 RPM, de snelheid die voor alle volgende wasstappen wordt gebruikt, gedurende één minuut. Verwijder daarna het objectglazenrek uit wasbuffer A en spoel dit kort af met wasbuffer D. Verplaats het objectglazenrek naar wasbuffer B en was dit vijf minuten lang op de orbital shaker.

Droog na het wassen de arrays op elke slide voorzichtig af met een papieren doekje en plaats de gedroogde slides in de bevochtigingskamer. Ter voorbereiding op de stappen voor de fox colorimetrische detectie worden voor elke te verwerken array 10 µL amplitude, 20 µL tweevoudige amplitudebuffer en 10 µL gezuiverd water gecombineerd; breng 40 µL van het labelmengsel over naar elke array en laat de labelingsreactie vijf minuten plaatsvinden in een gesloten bevochtigingskamer. Bereid tijdens de hybridisatie 110 mL wasbuffer C in een container voor. Spoel na de labeling elke array onmiddellijk af met wasbuffer D. Plaats elke slide in het sliderek en was deze met wasbuffer C op de orbitale schudder gedurende vijf minuten; dompel het sliderek na het wassen met buffer C driemaal kort onder in een container met gezuiverd water.

Om zoutresten te verwijderen, worden de arrays gedroogd zoals eerder aangetoond. Bewaar de arrays in een donker schuifdoosje tot de foto-activatie en beeldvorming, welke binnen 24 uur voltooid moeten zijn. Zet vervolgens de Amli Fox-lezer aan en controleer of de Amli view-software gereed is voor foto-activatie voorafgaand aan de detectie van het array-monster.

Bepaal eerst de optimale fotoactivatietijd voor alle monsters door een korte kalibratieprocedure te volgen. Verwarm bij dagelijks gebruik de Amplify-oplossing tot kamertemperatuur en vortex kort om te mengen; pipetteer vervolgens drie µL amplify enhancer in het amplify-vial en vortex grondig. Breng gedurende 10 seconden gelijkmatig 40 µL Amplify-oplossing aan op slechts één dia tegelijk, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Plaats de microarray-dia in het foto-activeringsvak van de Amplify Reader. Start de foto-activering door op 'start' te klikken in de PL view-software, met de foto-activeringstijd die tijdens het kalibratieproces is vastgesteld. Spoel de microarray na voltooiing af met twee milliliters gezuiverd water om overtollig amplify clear te verwijderen; polymeervorming heeft nu plaatsgevonden op spots die target DNA bevatten, maar is nu beter zichtbaar.

Laat de polymere spots na het kleuren twee minuten drogen. Verdeel vervolgens twee druppels amply red over de array en laat het kleuringsproces twee minuten doorgaan. Spoel de slide na het kleuren snel af met gezuiverd water en droog deze zoals eerder beschreven; plaats de slide vervolgens in de imaging bay van de Amli Fox-reader om een afbeelding vast te leggen en gebruik de amli-software om de resultaten te verwerken. De linker afbeelding toont de detectie van een 2009 novel H1N1-monster door Amli Fox.

Hoewel de afbeelding rechts gebruikmaakt van traditionele fluorescentie gegenereerd door een confocale fluorescentie-microarrayscanner, is hetzelfde algemene detectiepatroon voor beide methoden gemakkelijk zichtbaar. Het resultaat van de Amli fox is echter met het blote oog zichtbaar. Deze afbeeldingen tonen flu-chipresultaten van menselijke oorsprong, H3N2 menselijke oorsprong, H1N1 varkensherkomst, H1N1 en een negatieve vos-array zonder detecteerbare influenza.

Sequenties twee en drie, omkaderd in het blauw, produceren signaal voor alle getoonde influenzasubtypes, maar de sequenties die rechtsonder in het rood zijn omkaderd, produceren alleen signaal voor het exemplaar van varkensherkomst, H1N1. Het negatieve exemplaar vertoont signaal op een interne controlesequentie, omkaderd in het groen, wat aangeeft dat er geen inhibitie of falen van de RT-PCR-reactie is opgetreden.

Zodra men de methode beheerst, kan het volledige proces, van extractie uit het buisje tot amox-detectie en de uiteindelijke resultaatinterpretatie, in ongeveer zes uur worden uitgevoerd. Het gedeelte van de procedure voor de Ampl Fox-detectie, inclusief de instrumentkalibratie, kan in ongeveer 30 minuten worden voltooid na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals gedeeltelijke of volledige genoomsequencing, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.

Deze influenza-assay is bedoeld als eerste screening, in het bijzonder voor monsters die resulteren in een uniek hybridisatiepatroon. Omdat de detectie een algemene assay is, hopen we dat onderzoekers nieuwe en interessante toepassingen voor microarrays met een lage dichtheid zullen vinden waarbij detectie waarde kan toevoegen.