Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

Meer dan 50 jaar geleden werd de hypothese opgesteld dat terminaal gedifferentieerde cellen, zoals huidfibroblasten, gedwongen konden worden om een pluripotente staat aan te nemen die vergelijkbaar is met die van embryonale stamcellen. De basis voor dit concept was de waarneming dat alle celtypen, op enkele kleine uitzonderingen na, dezelfde genetische code hebben en dat het enige verschil tussen celtypen ligt in de manier waarop deze code wordt gelezen. Dit vermogen om de cellulaire identiteit van een gedifferentieerde cel te veranderen naar een pluripotente staat wordt cellulaire herprogrammering genoemd.

Na vijf jaar onderzoek is onlangs aangetoond dat de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren huidfibroblasten kan herprogrammeren tot pluripotente cellen. De impact van deze ontdekking is enorm. Naast het belang voor de fundamentele biologie, neemt dit ook de belangrijkste ethische bezwaren weg tegen het gebruik van menselijke embryonale stamcellen voor transplantatietherapie.

Om herprogrammering mogelijk te maken, moeten vier genen die coderen voor de transcriptiefactoren Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4 worden verpakt en in een lentivirus worden gebracht. Een weefselkweekmedium dat gezuiverd virus bevat, wordt vervolgens toegevoegd aan een celkweekschaal met een hoge dichtheid aan fibroblasten, waarna er in die schaal iets bijzonders gebeurt. Een klein deel van de fibroblasten raakt geïnfecteerd met alle vier de virussen die de transcriptiefactoren dragen en begint te dedifferentiëren.

Ze ondergaan drastische veranderingen in hun morfologie en proliferatie en beginnen zich te delen in grote sferische clusters van pluripotente stamcellen. Na twee tot drie weken kweek onder embryonale stamcelcondities kunnen kolonies van gereprogrammeerde fibroblasten handmatig worden geïsoleerd en in vitro worden uitgebreid. Eenmaal gezuiverd kunnen deze cellen worden gebruikt om chimere muizen te genereren, waarbij een bepaald percentage cellen afgeleid van deze gededifferentieerde fibroblasten kan bijdragen aan verschillende weefsels van de muis.

In chimeren waarin het genetisch materiaal van de oorspronkelijke fibroblasten heeft bijgedragen aan de kiemlijn, wordt de genetische code doorgegeven aan de volgende generatie en vervolgens aan de generaties daarna. Hoewel het gebruik van een viraal afleversysteem momenteel een belemmering vormt voor klinische toepassingen, zal dit waarschijnlijk op korte termijn worden opgelost. In deze video zullen leden van het yin-lab demonstreren hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen worden afgeleid van embryonale fibroblasten van muizen.

Hallo, ik ben Grant Welted van het laboratorium van Rudolph Jish aan het Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. En ik ben Tobias Bro brink, ook van het Jish-lab. Vandaag laten we u de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen zien door de introductie van vier cDNA's: OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC, gebruikmakend van lentivirussen die deze vier cDNA's tot expressie brengen via een Tet-On CMV-promotor.

Dit maakt een nauwkeurige controle mogelijk van de expressie van deze vier transgenen na de infectie van embryonale fibroblasten van muizen. Het protocol dat we vandaag laten zien, omvat de hantering van lentivirus dat mogelijk menselijke cellen kan infecteren. Het is essentieel dat u altijd de veiligheidsprocedures volgt en contact opneemt met uw veiligheidsfunctionaris voordat u dit zelf probeert uit te voeren.

Laten we nu some iPS-cellen genereren om lentivirus te produceren dat mes-cellen zal converteren naar iPS-cellen. 293-cellen moeten worden getransfecteerd met drie plasmiden: pAKS2, dat de benodigde genetische elementen voor virale packaging biedt; de virale backbone, wat een FUW-TE-OCMV-lentivirus is met een van de vier cDNA's (T4, SOX2, KLF4 of c-MYC); en pMDG, dat het envelop-glycoproteïne van het vesicular stomatitis virus (VSV) tot expressie brengt.

Hiermee wordt het virus gemaakt dat het atrope virus zal genereren. Daarom moeten de juiste BSL-2+ procedures worden gevolgd. In deze specifieke video werken we niet met infectieus virus, dus dragen we geen typische jassen en bevinden we ons niet in onze BSL-2+ faciliteit.

Vóór de transfectie worden 2, 9 3 cellen ontdooid uit vloeibare stikstof en gekweekt tot 90% confluentie. De cellen worden vervolgens getransfecteerd met het FU-gen en krijgen 48 tot 72 uur de tijd om het virus tot expressie te brengen, waarna het medium waarin de cellen zich bevinden wordt gefilterd met een 0,45 micron filter en geconcentreerd via ultracentrifugatie. Na het concentreren van het virus zijn we klaar om de MES te infecteren om IPS-clusters te genereren. Tijdens de stappen van de virale preparatie worden muis embryonale fibroblasten met minder dan drie passages gekweekt tot 90% confluentie in 10 centimeter schalen, met ongeveer 2 × 10⁶ cellen per schaal. In dit specifieke experimentele protocol gebruiken we MES die RTTA tot expressie brengen, wat essentieel is voor doxycycline-expressie, en GFP vanuit de endogene OC vier locus.

MES zijn GFP-negatief, maar echte IPS-cellen worden GFP-positief. Deze marker maakt een methode mogelijk om gereprogrammeerde mes-cellen te identificeren; aspireer het kweekmedium van de fibroblasten en was met 10 ml HEPES-EDTA, verwijder het HEPES-EDTA en voeg 5 ml 1× trypsine toe en incubeer 10 minuten bij 37 °C. Trypsine helpt om de cellen van de bodem van de schaaltjes los te maken.

Voeg nu negen ml kweekmedium toe om de cellen te resuspenderen tot een enkelcellige suspensie en breng dit over naar een buis van 15 ml. Deze cellen worden vervolgens gecentrifugeerd om een pellet te vormen. Na het resuspenderen van de pellet wordt het aantal cellen in de suspensie geteld en wordt de concentratie aangepast naar 8 × 10⁴ cellen per ml.

Vervolgens worden 10 ml van de celsuspensie overgebracht naar een schaal van 10 centimeter die is gecoat met gelatine. Incubeer de schaal overnacht bij 37 °C en 5% CO2. Na de overnachtelijke incubatie wordt het medium uit een fibroblastschaal geaspireerd en worden 10 ml van het virushoudende medium aan de schaal toegevoegd. Incubeer de cellen gedurende vier uur tot overnacht bij 37 °C en 5% CO2.

Aspireer de volgende dag het medium uit een schotel met fibroblasten en voeg vervolgens 10 ml vers ESL-medium toe. In dit stadium kunnen de cellen worden ingevroren, uitgebreid of voorbereid voor de start van de herprogrammering. Om de herprogrammering te initiëren, vervangt u het reguliere ESL-medium door medium dat doxycycline bevat om de expressie van de vier genen op te starten.

Plaats deze cellen in de incubator en ververs het medium dagelijks totdat de kolonies groot genoeg zijn om te worden opgepikt. Kolonies zouden ongeveer een week na de start van de herprogrammering zichtbaar moeten worden. Ze zouden rond dag 20 groot genoeg moeten zijn om te worden opgepikt.

Nu er 20 dagen zijn verstreken, kunnen we overgaan tot het plukken van IPS-kolonies. Men dient erop te letten dat het benodigde aantal met gelatine gecoate 24-wells platen met gamma-bestraalde DR vier mythen één tot twee uur voor het plukken gereedstaan. De kolonies op de platen moeten worden gevoed door vlak voor het plukken vers medium toe te voegen; voeg onmiddellijk voor het plukken 50 µL HEPA-buffer toe aan de wells van een 96-wells V-bodem dish. Was de dish met de te plukken kolonies één keer met PBS en voeg 10 ml PBS toe aan de dish. IPS-celclusters kunnen worden geplukt met behulp van een stereomicroscoop of een omgekeerde microscoop.

Pak de koloniën met een kleine pipetsptip en breng ze over naar een putje in de 96-wells plaat met PBS om de clusters te verwijderen. Teken met een pipetpunt een cirkel rond het cluster om de klonten op te breken. De gereprogrammeerde cellen kunnen nu worden geëxtraheerd met behulp van een multichannel pipet, waarbij aan elk putje 20 µL trypsine wordt toegevoegd.

Pipetteer het mengsel drie keer op en neer en incubeer dit gedurende vier minuten bij 37 °C. Voeg na de incubatietijd van vier minuten 100 µL ES-medium toe aan de tripps-nice-kolonies. Pipetteer dit 10 keer op en neer en transfer vervolgens zes klonen per keer.

Breng de cellen over van de 96-well plaat naar een 24-well plaat met een pipetpunt op elke tweede positie van de 12-plaatsen pipeteerder. De cellen worden vervolgens gekweekt op de 24-well plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 totdat de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken, waarbij het medium dagelijks wordt aangevuld met ES-celmedium; de cellen zullen waarschijnlijk over drie tot zeven dagen klaar zijn voor expansie. Enkele dagen later, wanneer de iPS-cellen confluent zijn, wordt het medium geaspireerd en worden de cellen gewassen met 1 mL PBS. Verwijder het PBS volledig en voeg 100 µL 1× trypsine toe; incubeer dit gedurende 10 minuten bij 37 °C. Voeg na incubatie met trypsine 400 µL ES-celmedium toe en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk op en neer te pipetteren om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.

De 500 µL enkelcel-suspensie uit de 24-wellsplaat wordt vervolgens overgebracht naar één well van een six-wellplaat en geïncubeerd in een incubator op 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen een confluentie van 80 tot 90% in de six-wellplaat bereiken. Op dit punt kunt u overgaan tot het amplifieren van cellen voor Southern-analyse, blasts, injecties, teratoomassays of in vitro differentiatie-assays. Vergeet niet om reservevoorraden van deze cellen te invriezen, zodat u deze kostbare voorraad iPS-cellen niet verliest.

We hebben zojuist aangetoond hoe pluripotentie kan worden geïnduceerd in muizem Embrionale fibroblasten met behulp van een induceerbaar antiviraal systeem. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.