Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Hallo, mijn naam is Brad Hamilton. Ik werk op de afdeling onderzoek en ontwikkeling hier bij STEM Gen. Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit embryonale fibroblasten van muizen.

Deze procedure kan worden gebruikt om zowel geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren als om het herprogrammeringsproces te bestuderen. Laten we beginnen. Start met het uitplaten van muis embryonale fibroblasten, of MEF-cellen, op een met gelatine gecoate schaal van 15 centimeter met een dichtheid van 4 × 10⁵ cellen per schaal.

Voeg nu 30 milliliters meth-groeimedium toe en incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 degrees Celsius en 5% carbon dioxide tot ze ongeveer 80% confluent zijn. Aspireer na afloop van de incubatie het medium en voeg 30 milliliters groeimedium toe, aangevuld met geconcentreerd lentivirus.

Schud de schaal voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het medium te waarborgen. Incubeer de cellen overnacht bij 37 °C en 5% CO2 om de virale transductie te voltooien. We gaan nu verder naar de door doxycycline geïnduceerde herprogrammering.

Om te beginnen met het herprogrammeren, 20 tot 24 uur na transductie, wordt trypsine toegevoegd aan de getransduceerde cellen, waarna deze vijf minuten worden gecentrifugeerd bij 200 Gs. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium van de celpellet en resuspendeer de cellen in groeimedium. Zodra ze zijn gesuspendeerd, worden de getransduceerde cellen uitgezaaid in een geschikte concentratie voor de grootte van de gebruikte kweekschaal.

Hier gebruiken we 2,5 × 10⁵ cellen per schaal van 10 cm voor experimenten naar de herprogrammeringsefficiëntie en de isolatie van iPS-kolonies, en 2 × 10⁴ cellen per putje in platen met vier putjes voor immunochemische experimenten. Om de transductie-efficiëntie te monitoren, worden de cellen overnacht geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2. In dit stadium kunnen de cellen, indien nodig, worden ingevroren in vloeibare stikstof voor toekomstige analyse.

Aspireer de volgende dag het medium en vervang dit door vers groeimedium dat is aangevuld met doxycycline tot een eindconcentratie van 2 µg/mL. We voegen een negatieve controle toe die bestaat uit medium zonder doxycycline. Incubeer de cellen tot slot bij 37 °C en 5% CO2.

We zijn gestart met het herprogrammeringsproces. In het algemeen zullen de pluripotente stamcelkolonies na 16 tot 22 dagen groot genoeg zijn voor isolatie.

Voordat we die procedure demonstreren, moeten we eerst de transductie-efficiëntie verifiëren met behulp van chemie om de transductie-efficiëntie te bepalen. Immunochemische testen worden uitgevoerd op cellen die 48 uur na doxycycline-inductie zijn overgeplaatst in platen met vier putjes. Alle in dit protocol vermelde volumes moeten worden aangepast aan de grootte van de celkweekplaat; begin met het voorzichtig wassen van de cellen.

Nadat de cellen zijn gewassen met PBS zonder magnesium- of calciumionen, worden de cellen gefixeerd met 500 µL 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten. Was de cellen vervolgens bij kamertemperatuur nogmaals voorzichtig twee keer met PBS. Permeabiliseer daarna de cellen door 500 µL ijskoud 0,2% Tween 20 in PBS toe te voegen en 10 minuten te incuberen bij kamertemperatuur.

Was de cellen nog twee keer. Voeg 200 µL blokkeringsbuffer toe gedurende één uur bij kamertemperatuur om aspecifieke antilichaambinding te blokkeren. Voeg nu 200 µL van het gewenste primaire antilichaam toe.

Hier maken we gebruik van de pluripotentiemarkers T 4K LF four, SOX two en cmic. Incubeer de cellen overnacht bij 4 °C. Was de cellen de volgende dag voorzichtig twee keer met PBS en incubeer ze vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met 200 µL secundair antilichaam, waarbij de platen tegen licht worden beschermd.

Hier maken we gebruik van de geschikte secundaire antilichamen geconjugeerd met fluoroforen voor visualisatie, waarbij we na incubatie een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gebruiken. Was de cellen nog twee keer en voeg vervolgens DPI toe en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten om de kernen te visualiseren. Voeg ten slotte, na een laatste wasbeurt, antifade mounting medium toe voordat de cellen met de omgekeerde fluorescentiemicroscoop worden afgebeeld om de transductie-efficiëntie te bepalen.

Begin de isolatie en expansie van pluripotente stamcellen. Controleer de culturen dagelijks na het starten van het herprogrammeringsproces en vervang het geschikte medium elke 48 uur. Wij gebruiken medium aangevuld met doxycycline om de cellen gedurende de eerste 12 dagen te kweken, waarna de doxycycline vervolgens uit het medium wordt verwijderd.

De geïnduceerde pluripotente stamcel- of IPS-kolonies die handmatig worden geselecteerd voor expansie zijn doxycycline. Onafhankelijke cellen moeten dagelijks worden gecontroleerd op morfologische veranderingen die wijzen op het herprogrammeringsproces. Elk experiment zal verschillen, maar kolonies zijn over het algemeen groot genoeg voor isolatie tussen 16 en 22 dagen na DS-inductie; de dag voordat u begint met het proces van het isoleren en trypsiniseren van de hergeprogrammeerde kolonies.

Bereid een plaat met 24 putjes voor door deze te zaaien met een gamma-bestraalde feederlaag van MEF's met een dichtheid van vijf keer 10⁴ cellen per putje. Incubeer de cellen overnight bij 37 °C en 5% CO2. Picker de volgende dag handmatig elke iPS-kolonie en trypsiniseer deze om de celaggregaten te dissociëren. Replanteer de iPS-cellen in medium voor embryonale stamcellen van muizen in de individuele putjes van de eerder voorbereide plaat met 24 putjes en incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.

Vervang het medium elke 24 uur. Controleer de iPS-kolonies dagelijks op groei en GFP-fluorescentie. Wij hebben onze culturen zes dagen geïncubeerd voordat we ze overbrachten naar platen met vier putjes voor de analyse van pluripotentie.

Stel vast welke wells van de 24-well plaat uniform GFP tot expressie brengen. Wells met een goede GFP-expressie kunnen worden getripeerd, geïnitieerd en in een verhouding van één op acht worden overgeplaatst naar four-well platen die vooraf zijn voorzien van gamma-bestraalde feederlagen van mes. Deze platen kunnen vervolgens worden gebruikt voor ICC-analyse om de analyse van de pluripotentie te starten. Was de cellen voorzichtig twee keer met PBS zonder magnesium- of calciumionen.

Voeg 0,5 milliliter per well ijskoude 0,2%between 20 in PBS toe en incubeer de cellen gedurende 10 minuten. Na drie aanvullende wasbeurten in PBS wordt aspecifieke binding geblokkeerd met 200 microliter blokkeringsbuffer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg nu 200 microliter van het gewenste primaire antilichaam toe.

Hier gebruikten we SSEA-1, Nanog en OCT4; incubeer de cellen een nacht bij 4 °C. Nadat de cellen voorzichtig twee keer zijn gewassen, worden ze één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met 200 µL secundair antilichaam, waarbij ze uit het licht worden gehouden. We maken hier gebruik van de juiste, met fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen voor visualisatie met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Voeg na nog twee wasbeurten DPI toe en incubeer de cellen gedurende 10 minuten.

Voeg na een laatste wasbeurt antifa aqua mount toe voordat de cellen met de omgekeerde fluorescentiemicroscoop worden afgebeeld. IPS-koloniën kunnen ook worden geanalyseerd op alkalische fosfatase-activiteit met behulp van commercieel beschikbare kits. De stem gent docs induceerbare muis TF lentivirus-set kan worden gebruikt om mes-cellen te herprogrammeren tot IPS-cellen na transductie van de MES voor expressie van transcriptiefactoren.

T four, SOX two, KLF four en seic kunnen worden aangetroffen in cellen die met doxycycline zijn behandeld, maar in onbehandelde cellen is weinig of geen expressie waarneembaar. Morfologische veranderingen zullen in de loop van de tijd vorderen om grotere, meer op ES-cellen lijkende kolonies te vormen met gedefinieerde kolonieranden en driedimensionale groei. Wanneer docs wordt verwijderd, is er bij sommige ES-celachtige kolonies een merkbare terugkeer van de cellulaire morfologie.

Veel van de kolonies behielden echter hun iPS-morfologie. Wanneer deze iPS-kolonies werden geïsoleerd en gepasseerd, vertoonden zij een typische expressie van pluripotentie-markers zoals alkalische fosfatase, nano T four en SSEA one.

Het type meth-cellen dat in dit experiment is gebruikt, expresseerde GFP vanuit de endogene nag-locus. Wanneer deze worden gereprogrammeerd naar de pluripotentietoestand, kan de GFP-expressie daarom worden gebruikt als een voorlopige indicator voor succesvolle reprogrammering. We hebben zojuist aangetoond hoe de reprogrammering van muis embryonale fibroblasten naar induceerbare pluripotente stamcellen kan worden opgewekt met behulp van een doxycycline-induceerbaar antiviraal systeem met vier transcriptiefactoren.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat bij het ontwerpen van herprogrammeringsexperimenten verschillende variabelen in overweging moeten worden gebracht om de efficiëntie van de herprogrammering te optimaliseren. Ten eerste is het mogelijk om de ratio van actief virus tot doelcel tijdens de primaire infectiestap aan te passen om de transductie-efficiëntie te verhogen of te verlagen, waardoor het aantal geïntegreerde virussen in de doelcelpopulatie wordt beïnvloed. Ten tweede kan het aanpassen van de blootstellingsduur van de cellen aan docs het aantal gegenereerde iPS-koloniën beïnvloeden.

Ten derde kan de proliferatiecapaciteit van de doelcellen de herprogrammering beïnvloeden, aangezien cellen die actief groeien en delen vatbaarder zijn voor herprogrammering. Ten slotte wordt aanbevolen om, bij het aanpassen van het protocol voor verschillende celaantallen of weefselkweekschaaltjes van verschillende grootte, de aantallen doelcellen proportioneel aan het oppervlak van het kweekschaaltje aan te passen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.