In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

Stamcellen hebben het opmerkelijke potentieel om zich te ontwikkelen tot vele verschillende celtypen in het lichaam. Ze dienen als een soort reparatiesysteem voor het lichaam en kunnen theoretisch onbeperkt delen om andere cellen aan te vullen.

Wanneer een stamcel zich deelt, heeft elke nieuwe cel het potentieel om ofwel een stamcel te blijven of om uit te groeien tot een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie. Dit veelbelovende vakgebied leidt ertoe dat wetenschappers de mogelijkheid van celgebaseerde therapieën onderzoeken om ziekten in vitro te behandelen. Differentiatie van embryonale stamcellen vindt plaats wanneer de cellen in staat worden gesteld om te aggregeren in suspensiecultuur.

In de afwezigheid van embryonale muis-fibroblast-feeder-cellen en leukemie-remmende factor worden deze celaggregaten embryoblasten genoemd. De hanging drop-methode is een effectieve procedure voor de in vitro differentiatie van stamcellen tot embryoblasten. Hallo, ik ben Sha Juan van de afdeling Cardiovasculaire Geneeskunde aan de Stanford University.

Vandaag laten we u een procedure zien voor de individuele differentiatie van embryonale stamcellen tot embryoïde lichamen met behulp van de hand-drop methode. Wij gebruiken deze methode doorgaans om embryonale stamcellen te differentiëren tot cardiomyocyten. Deze procedure omvat de volgende stappen: het bereiden van een enkelcellige suspensie van embryonale stamcellen, het genereren van hand-drop culturen, het overbrengen van hand-drop culturen naar platen met ultra-lage hechting en het uitplaten van de embryoïde lichamen op met gelatine gecoate platen.

Oké, laten we beginnen. De eerste stap van de procedure is het voorbereiden van een suspensie van enkelvoudige embryonale stamcellen. Omdat we onze ongedifferentieerde embryonale stamcellen kweken op embryonale fibroblasten van muizen, moeten we de cellen losmaken en scheiden van de fibroblasten.

Hiervoor trypsiniseren we de cellen volgens standaardprocedures. Zodra de trypsinbehandeling is voltooid, voegen we medium voor muizen embryonale stamcellen toe om de trypsine te neutraliseren. Verplaats vervolgens de celsuspensie naar een conische buis van 15 ml.

Breek vervolgens de celkolonies op door herhaaldelijk met de pipet op en neer te bewegen tegen de bodem van de buis, totdat een fijne celsuspensie zonder zichtbare klonters is verkregen. Centrifugeer de cellen daarna 5 minuten lang bij 1000 RPMs. Aspireer na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml mouse ES cell medium.

Breng de celsuspensie over naar een T 75-fles die vooraf is gecoat met 0,1% gelatine en incubeer gedurende één uur bij 37 °C met 5% CO2. Na één uur zijn de fibroblasten aan de plaat gehecht, maar blijven de stamcellen in het medium. Pipetteer het medium op om de stamcellen te verzamelen.

Centrifugeer de cellen vijf minuten lang bij 1000 RPM en aspireer het medium weg. Voeg vervolgens nog eens 10 ml differentiatiemedium toe en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk te pipetteren tot er een fijne cellsuspensie ontstaat. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.

We zijn nu klaar om de cel-suspensie te kweken met de hanging drop-methode. Om de hanging drop-kweek te starten, wordt differentiatiemedium gebruikt om de stamcel-suspensie te verdunnen tot een concentratie van 500 cellen per 20 µL. Keer vervolgens het deksel van een 150 mm weefselkweekplaat om.

Pipetteer vervolgens 20 µL van de cel-suspensie op het binnenoppervlak van de plaatdeksel. Voeg met een multichannel-pipet 10 mL PBS toe aan de plaat. Keer het plaatdeksel snel om en plaats het voorzichtig op de plaat om de hangende druppels te vormen.

Zodra de plaatkap is geplaatst, wordt de plaat voorzichtig overgebracht naar de incubator. De cellen blijven gedurende twee dagen ongestoord. Wanneer de incubatie is voltooid, gaan we over tot het overbrengen van de hanging drop-cultuur naar ultra-low attachment platen.

Draai na twee dagen voorzichtig de plaatdekking om, aspireer vervolgens 180 µL vers differentiatiemedium en breng enkele druppels over naar een 96-well ultra-low attachment plaat. Neem de druppels vervolgens op met een pipet en breng ze één voor één over naar de 96-well plaat. Plaats de platen gedurende drie dagen ongestoord in de incubator.

De embryo-lichamen zullen verder groeien tot een bolvorm. Wanneer de incubatie is voltooid, zijn we klaar om de embryo-lichamen uit te platen om de embryo-lichamen te helpen verder te differentiëren.

We brengen ze over naar een 48-well plaat gecoat met gelatine. Hiervoor coaten we eerst elke well van de plaat met 300 µL 0,1% gelatine. Na het toevoegen van de gelatine wordt de plaat een nacht geïncubeerd bij 37 °C.

Aspirer de volgende dag de gelatine uit de 48-wellplaat. Voeg vervolgens 300 µL differentiatiemedium toe aan elke well. Verplaats nu de embryo-lichamen één voor één van de 96-wellplaat naar de met gelatine gecoate 48-wellplaten.

Normaal gesproken vervangen we het medium de volgende dag en daarna om de dag om de cellen in stand te houden. We gebruiken deze methode om te zoeken naar betere protocollen voor de differentiatie van embryonale stamcellen. Wat betreft de cardiomyocyten, we hebben zojuist gedemonstreerd hoe u de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen uitvoert met behulp van hanging drop-culturen.

Deze methode is effectief omdat de ronde bodem van de hangende druppel de aggregatie van embryonale stamcellen mogelijk maakt, waardoor een goede omgeving ontstaat voor de vorming van embryoid bodies. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het aantal geaggregeerde embryonale stamcellen in een hangende druppel kan worden gecontroleerd door het aantal cellen in de initiële celsuspensie te variëren. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.