Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om muis-embryonale stamcellen te differentiëren tot motorneuronen. Kweek eerst muis-embryonale stamcellen op primaire muis-embryonale fibroblasten en vul deze aan met leukemia inhibitory factor. Verbeter vervolgens het normalisatieproces door noggin, bFGF en FGF8 toe te voegen. Induceer de specificatie van motorneuronen door incubatie met retinoïnezuur en een smoothened-agonist, gevolgd door axonale elongatie en rijping van de motorneuronen.

Gebruik ten slotte immunofluorescentiemicroscopie om gedifferentieerde MES-cellen te onderzoeken die een sterke GFP-fluorescentie vertonen. Het genereren van grote hoeveelheden motorneuronen vergemakkelijkte onderzoek naar motorneuronenziekten in vergelijking met huidige bestaande protocollen. Deze benadering voor het differentiëren van embryonale stamcellen van muizen tot motorneuronen is efficiënter. Deze methode kan inzicht bieden in spinale musculaire atrofie.

Het kan ook worden toegepast op andere motorneuronenziekten, zoals amyotrofische laterale sclerose. Om primaire embryonale muisfibroblasten uit te platen, worden vier weefselkweekschalen van 100 millimeter gecoat met acht milliliter 0,1% gelatineloplossing. Na 30 minuten bij kamertemperatuur wordt het overtollige vloeistof verwijderd. Verdun vervolgens één vial mitomycine C in geactiveerde PMEF in 40 milliliter PMEF-medium, plaat dit op de vier schalen en kweek dit gedurende maximaal één week.

Ontdooi vervolgens één vial MES-cellen in een waterbad van 37 °C. Was de cellen met vijf milliliter E ES-medium in een buis van 15 milliliter. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 800 RPM.

Zuig het supernatant af en resuspendeer de MES-cellen in 20 milliliters ES-medium met vers toegevoegd leukemia inhibitory factor. Verwijder vervolgens 10 milliliters medium uit de PMEF-culturen en vervang dit door 10 milliliters van de HBG drie ES-cel-suspensie. Monitor de progressie van de MES-cellen in de loop van de tijd, van kleine kolonies na 24 uur tot kolonies van ongeveer 100 micrometers in diameter 72 uur na het uitplaten.

Vervang het medium dagelijks om de proliferatie van cellen voor de inductie van MES-cellen te behouden. Differentiatie tot motorneuronen. De embryonale stamcellen van de muis moeten eerst worden gescheiden van de PMEF-feeder-cellen en vervolgens op de dag van inductie in een suspensieomgeving worden gekweekt.

Bereid voor elke ES-kweek van 100 millimeter een T25-fles voor die is gecoat met 0,1% gelatine. Verwijder na 30 minuten bij kamertemperatuur de overtollige gelatine en was drie keer met PBS. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium van de ES-kweek, waarbij u ervoor zorgt dat losjes gehechte kolonies niet worden verplaatst. Was daarna eenmaal met 10 milliliter PBS.

Om de MES-cellen van de PMEF te scheiden, voegt u drie milliliter 0,25%trypsine EDTA toe en incubeert u dit gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C. Controleer of de stamcellen en de PMEF zijn losgekomen van de plaat. Voeg vervolgens 15 milliliter vers ES-medium toe en breek de kolonies open door te pipetteren.

Breng de cel-suspensie over naar de voorbereide met gelatine gecoate T 25-fles en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 37 °C, zodat de PFS kunnen hechten aan het gegelatiniseerde oppervlak. Oogst nu de zwevende MES-cellen in een buis van 50 ml en pellet deze door centrifugatie. Resuspendeer de cellen in 10 ml neurale differentiatie-medium.

Tel het medium met een hemocytometer en zaai dit vervolgens uit op een 100 millimeter schotel voor suspensiecultuur voor differentiatie. Verifieer op dag één via microscopie of de MES-cellen kleine zwevende aggregaten hebben gevormd, genaamd embryonale lichaampjes. Aangezien eventuele overgebleven PMEF aan de schotel hechten, worden de ES-suspensiecellen en het medium overgebracht naar een 15 milliliter buis en vervolgens drie minuten gecentrifugeerd bij 500 RPM.

Om de embryonale lichamen te oogsten, wordt het medium voorzichtig afgezogen, waarna 10 milliliters vers neuraal differentiatiemedium aan de gepellette ebs wordt toegevoegd, waarna de cellen gedurende 24 uur op differentiatie in een nieuwe bacteriële kweekschaal worden geplaatst. Op dag twee wordt de kweekschaal rondgedraaid en worden het medium en de EBS overgebracht naar een 15 milliliter buis. Laat de EBS door zwaartekracht bezinken, zuig vervolgens het medium voorzichtig af en resuspendeer de EBS in 10 milliliters motorneuron-differentiatie.

Kweek EBS in een nieuw bacteriologisch schaaltje gedurende vijf dagen voor differentiatie. Verifieer op dag zeven dat de EBS ongeveer 150 tot 200 µm in diameter zijn en sterke GFP-signalen vertonen bij differentiatie. Plaats op dag vijf, twee dagen vóór het dissociëren van de EBS, ronde dekglasjes van 12 mm op de bodem van een 24-wells plaat.

Voeg vervolgens 0,5 milliliters 100 micrograms per milliliter poly-DL-ornithine toe en incubeer dit gedurende de nacht bij vier degrees Celsius. Aspireer de poly-DL-ornithine, laat de platen en dekglasjes aan de lucht drogen in een weefselkweekkap en spoel de putjes van de plaat drie keer na met dubbel gedestilleerd water.

Laat aan de lucht drogen om de dekglasjes te coaten. Maak een verse verdunning van 2 µg/mL muis laminine in 5 mL ijskoud 1X PBS. Voeg 0,5 mL per well toe en incubeer gedurende de nacht bij 4 °C.

Was twee keer met PBS bij differentiatie. Verzamel op dag zeven de EBS in een buis van 15 milliliter en laat de EBS bezinken door zwaartekracht. Voeg na vier wasbeurten met PBS één milliliter ACU max toe aan de EBS, meng voorzichtig en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur, en aspireer vervolgens het overtollige ACU max dat de EBS bedekt.

Voeg nu drie milliliter MND-medium toe en dissociate de EBS door ongeveer 20 keer te pipetteren met een een milliliter einor micropipet, incubeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en breng de celsuspensie via een cell strainer cap over in een 12 bij 75 millimeter buis. Herhaal deze dissociatiestap met de resterende klontjes en cellen die door het filter zijn tegengehouden om de opbrengst van enkelvoudige cellen te verhogen tot een uiteindelijke enkelvoudige celsuspensie van zes milliliter. Meng de enkelvoudige celsuspensie voorzichtig en tel de cellen met een hemocytometer; verdun de cellen in compleet MND-medium tot een dichtheid van 2 × 10⁵ cellen per milliliter voordat u deze uitplaat.

0,5 milliliters cel-suspensie per putje van de klaargemaakte 24-wells platen die cover slips bevatten gecoat met poly DL-ornithine laminine. De gedifferentieerde cellen vormen na twee dagen lange neurieten. In cultuur is HBG drie een ES-cellijn afgeleid van een transgene muis die EGFP tot expressie brengt onder controle van een motorneuron-specifieke promotor HB nine met een gedefinieerd differentiatieprotocol.

MES-cellen kunnen worden gebruikt voor het afleiden van motorneuronen. De ongedifferentieerde MES-cellen vormen ronde kolonies bovenop een feederlaag van fibroblasten. Ze vertonen een zwakke GFP-expressie.

Deze MES-cellen werden gescheiden van de feederlagen en gekweekt op schalen met een lage aanhechting om embryonale lichamen te vormen. Gedifferentieerde MES-cellen vertoonden na dag zeven een sterke GFP-fluorescentie. Gedifferentieerde EBS werden gedissocieerd en geplaatst op platen gecoat met poly-DL-ornithine laminine.

De gedifferentieerde cellen vormen na twee dagen in cultuur lange neurieten vanuit de cellichamen van de geplaatste cellen; de uit MES-cellen afgeleide motorneuronen kunnen worden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring. Deze GFP-positieve cellen brengen de pan-neuronale marker neurofilament en de twee motorneuron-specifieke markers tot expressie. Islet-1 en cholineacetyltransferase, terwijl DPI de kernen kleurt.

Ons twee-staps differentiatieprotocol biedt een efficiënte methode om MES-cellen te differentiëren tot spinale motorneuronen. Na het bekijken van deze video zou u inzicht hebben in hoe muizenembryonale stamcellen efficiënt kunnen worden gedifferentieerd tot motorneuronen. Tot slot dient u te onthouden dat een hoge kwaliteit van de muizenembryonale stamcellen de meest kritische parameter is voor het efficiënt genereren van motorneuronen.