Paradigma's voor farmacologische karakterisering van C. elegans synaptische transmissie Mutants

Hoi, ik ben Cody Locke van het Caldwell Laboratory van de afdeling Biological Sciences aan de University of Alabama. Ik ben Kyle Lee en ik zal laten zien hoe u wormen voorbereidt voor outta carb- en PTZ-blootstellingsassays. Ik ben Bernard Tu en ik zal u demonstreren hoe u out carb-assays uitvoert.

Ik ben Kaylin Berry en ik ben verantwoordelijk voor de C. elegans-video's. In deze presentatie zal ik de verspreking verzorgen en de PTZ-blootstellingsassay demonstreren. Vandaag zullen mijn collega's en ik laten zien hoe synaptische transmissiemutanten kunnen worden gekenmerkt met een C. elegans-model voor epilepsie na blootstelling aan PTZ en Aldicarb, met behulp van een reeks representatieve mutantstammen.

Laten we beginnen. Kyle Lee start vandaag met het demonstreren van de voorbereiding van ALD carb-assays op de eerste dag van de procedure. Zorg ervoor dat er op de tweede dag ten minste 30 wormen in het stadium van jonge volwassenen van elk genotype en van elke replica beschikbaar zijn voor de ALD carb-assays.

Het is aanbevolen dat de experimentator 50 of meer L4-stadium wormen overbrengt naar verse, fungicide-vrije NGM-platen waarin e coli OP 50 is gezaaid als voedingsbron. Kweek de wormen gedurende 12 tot 24 uur bij een constante en permissieve temperatuur. 20 °C tot 22 °C is optimaal, hoewel 25 °C acceptabel is.

Maak op de tweede dag een 100 millimolaire voorraadoplossing van Al Decarb en 70% ethanol en verspreid de juiste hoeveelheid Al Decarb over NGM-platen. Wij gebruiken consequent 0,5 millimolaire Al Decarb door 37,5 microliter 100 millimolaire Al Decarb te platen op 60 millimeter niet-geventileerde Petriplaten met 7,5 milliliter NGM. Laat de Al Decarb-platen ongeveer 30 tot 60 minuten drogen bij kamertemperatuur.

Het is niet nodig om de deksels open te breken nadat de platen droog zijn. Voeg consistente volumes E. coli toe aan het centrum van elke alde carb-plaat en laat deze nog 30 tot 60 minuten drogen. Bij kamertemperatuur voegen we doorgaans 25 µL E. coli OP 50 toe.

Dit volume OP 50 creëert een voedingsbodem van voldoende grootte om de wormen in een klein gebied in het centrum van de plaat te houden zonder dat er overbevolking optreedt. Zodra de voedingsbodem droog is, kunnen de albacarban-assays worden uitgevoerd. Vanwege de subjectieve aard van albacarban-assays wordt sterk aanbevolen om de experimenten blind uit te voeren.

Om dit te doen, herlabelt een collega van de primaire experimentator de oorspronkelijke platen met de wormen die geanalyseerd moeten worden, of kan de collega de wormen vlak voor het starten van de timer overbrengen van de oorspronkelijke platen naar cipher alde carb platen. Nu de platen zijn voorbereid, gaat ABO verder met de analyse; om de analyse te beginnen, wordt het aantal verlamde wormen geteld.

Er zijn twee hoofdbenaderingen om acute al-decarb-geïnduceerde verlamming te definiëren. De eerste benadering definieert verlamming als het stoppen van het pharyngeale pompen. In deze videonota is een donkere structuur te zien die zich bevindt in het lumen van de farynx van de worm aan de rechterkant van het scherm.

Deze structuur wordt de maalkeuze genoemd en trekt ritmisch samen via een cholinerg mechanisme. De voortbeweging van de worm in deze video is sterk vertraagd door blootstelling aan Al Decarb. Toch beweegt de faryngeale maalkeuze van deze worm nog steeds duidelijk.

Daarom is deze worm niet verlamd volgens de definitie van het staken van het pompen. In deze video moet men zien dat de faryngeale maaler aan de rechterkant van het scherm niet samentrekt, waarbij het staken van het pompen als de werkdefinitie voor door al Decarb geïnduceerde verlamming geldt. Deze worm moet als verlamd worden gescoord.

Echter, net als de worm in de vorige video, vertoont deze worm lichte zijwaartse foerageerbewegingen. Ondanks dat de voortbeweging is belemmerd door Al Decarb, zouden deze bewegingen een experimentator beletten om deze worm als verlamd te beschouwen volgens de tweede benadering om door al Decarb geïnduceerde verlamming te definiëren: volledige immobiliteit van het lichaam en geen reactie op aanraking. De tweede benadering om door al decarb geïnduceerde verlamming te definiëren houdt in dat elke worm consistent wordt geprikkeld met een platina draad om te controleren op een respons.

Indien lichaamsbewegingen met het blote oog niet gedetecteerd kunnen worden, is onze voorkeursmethode om de wormen elke 30 minuten twee keer op de kop en twee keer op de staart te prikken gedurende een totale periode van drie uur. Zoals u kunt zien, beweegt de worm in deze video zijn lichaam niet duidelijk. Desondanks beschouwen we deze worm niet als verlamd, aangezien hij op het prikken reageert door duidelijk met zijn staart te bewegen.

Volgens de tweede definitie betreft dit een door decarb geïnduceerde verlamming. Net als de worm in de vorige video beweegt deze worm zijn lichaam niet duidelijk en vereist hij daarom een prikkeltest. In tegenstelling tot de worm in de vorige video reageert deze worm echter niet duidelijk op de prikkeling.

Daarom is deze worm verlamd volgens de tweede definitie van door al decarb geïnduceerde verlamming. Hoewel het verschil tussen wel en niet verlamd zijn door al decarb subtiel kan zijn, zouden experimentatoren in staat moeten zijn om aanzienlijke veranderingen in de synaptische transmissie te identificeren door simpelweg grote aantallen representatieve wormen te observeren die onmiddellijk na het overzetten op Al Decarb-plaatjes aan Al Decarb zijn blootgesteld. Wildtype wormen zijn nog steeds mobiel.

In deze video is te zien hoe dezelfde wild-type wormen uit de vorige video eruitzien na één uur blootstelling aan Al Decarb. Let op dat de wormen tot op zekere hoogte vertragen, maar nog steeds duidelijk in beweging zijn.

In tegenstelling tot wormen van het wilde type, zijn de Tomasin one-mutanten in deze video na één uur blootstelling ofwel volledig geïmmobiliseerd of bewegen ze nauwelijks. Dit resultaat is consistent met het feit dat Tomasin one-mutanten een overmaat aan acetylcholine secreteren vanwege een onvermogen om de afgifte van neurotransmitters bij neuromusculaire juncties negatief te reguleren; de overmaat aan acetylcholine in de synaptische spleten bij neuromusculaire juncties in combinatie met de remming van de afbraak van acetylcholine door Bial Decarb maakt Tomasin one-mutanten hypersensitief. Hoewel hier niet getoond, is verondersteld dat soortgelijke resultaten voortkomen uit alde carb-assays met loss-of-function allelen van on 43, dat codeert voor de C elegance-ortholoog van calcium-calmoduline-afhankelijke proteïnekinase twee. Deze video toont on 25-mutanten, die een deficiëntie hebben in de inhiberende GABAerge transmissie.

Na één uur blootstelling aan alde carb vertonen deze mutanten, vergelijkbaar met tomasin one en M 43-mutanten, significante alde carb-geïnduceerde stoornissen in de locomotoriek en lijken sterker beïnvloed te zijn dan wild-type wormen bij blootstelling aan al Decarb gedurende eenzelfde tijdsduur. Dit resultaat is consistent met het feit dat M 25-mutanten overgestimuleerde lichaamswandspieren hebben door een combinatie van blootstelling aan al Decarb en verminderde GABAerge transmissie, wat leidt tot een hogere ratio van excitatoire naar inhibitoire transmissie bij de neuromusculaire juncties van CL ELs en daaropvolgende verlamming. Toch vertonen tomasin one on 43 en on 25-mutanten vergelijkbare gevoeligheden voor Al Decarb op dit tijdstip.

Hoewel de oorzaken van overstimulatie van de lichaamswandspieren verschillen, kan een experimentator het onderliggende mechanisme voor hypersensitiviteit niet kennen zonder eerst de identiteit van de veroorzakende mutaties te weten. Voor deze video zijn we teruggekeerd naar dezelfde wild-type wormen uit een eerdere video na drie uur blootstelling aan ALD-carb; op dit eindpunt van onze ALD-carb assay moet men duidelijk kunnen zien dat deze wormen, ondanks dat ze wild-type zijn, ofwel volledig geïmmobiliseerd zijn of nauwelijks bewegen. Deze wormen zijn nu fenotypisch vergelijkbaar met de TOM-1 en M-25 mutanten die getoond werden één uur na blootstelling aan ALD-carb, vermoedelijk omdat de exciterende cholinerge transmissie vergelijkbare niveaus heeft bereikt; in tegenstelling tot wild-type wormen blijven Synap Bren-1 mutanten aanzienlijk mobiel na drie uur blootstelling aan ALD-carb.

Dit resultaat is consistent met Synaptive Bren one-mutanten, die normale niveaus van neurotransmittersecretie missen en minder cholinerge stimulatie bij hun lichaamswandspieren vertonen dan wild-type wormen na identieke niveaus van alde carb-blootstelling op dit tijdstip. Point on four-mutanten, die specifiek een deficiëntie in de cholinerge transmissie hebben, zouden een vergelijkbare gevoeligheid voor Al Decarb moeten hebben als Synaptive Bren one-mutanten. Omgekeerd blijven Tomasin one- en O 25-hypersensitieve mutanten verlamd, net als wild-type wormen.

Het is vermeldenswaard dat sommige wormen, vooral die resistent zijn tegen Al Decarb, kunnen proberen van de plaat af te kruipen. In dat geval kan de experimentator een consistente hoeveelheid palmitinezuur aanbrengen, wat een fysieke barrière vormt voor de voortbeweging van de wormen. Rond de Al Decarb-platen hebben we 25 µL van 10 mg palmitinezuur per mL ethanol verspreid.

Hiermee is het blootstellingsparadigma voor Al Decarb voltooid. Nu zal ik het blootstellingsparadigma voor Penta Lean Terazol demonstreren. Kaylin Berry zal ons helpen bij de PTZ-assays.

De voorbereiding van wormen voor PTZ-assays is in essentie gelijk aan de voorbereiding van wormen voor alde-carb-assays. De enige significante verschillen tussen de twee assays zijn de volgende. We gebruiken DDH two O als PTZ-oplosmiddel in plaats van 70% ethanol.

Daarnaast laten we de platen minstens één uur drogen voordat we OP 50 toevoegen, omdat we vaak grotere volumes PTZ uitplaten dan ALDE carb. Palmitinezuur kan ook worden gebruikt bij PTZ. Het is bovendien belangrijk op te merken dat PTZ veel minder stabiel is dan alde carb en bij -20 °C bewaard moet worden.

Om de analyse te beginnen, telt u elke 30 minuten het aantal epileptische wormen met lichtconvulsies gedurende een totaal van één uur. Het is optimaal om het aantal wormen met verschillende typen convulsies in aparte categorieën te scoren, zoals volledige lichaamsconvulsies, anterieure convulsies (die wij head bobs noemen), een combinatie van anterieure convulsies met verlamming van de lichaamswandspieren (die wij tonisch-clonisch noemen) of volledige lichaamsverlamming (die wij tonisch noemen). Aanvallen zoals te zien is bij de worm rechts volgen vaak op tonisch-clonische convulsies, zoals te zien is bij de worm links tonisch.

Toezakingsachtige activiteit zou simpelweg het gevolg kunnen zijn van spiervermoeidheid na repetitieve tonisch-clonische convulsies. Ongepubliceerde gegevens van ons wijzen echter uit dat sommige wormen onder invloed van PTZ tonisch kunnen worden op een manier die vergelijkbaar is met door al decarb geïnduceerde verlamming, zonder dat zij daarvoor tonisch-clonisch waren. Hier tonen we een representatieve synaptische transmissiemutant worm die kruipt in de afwezigheid van PTZ, een GABA-receptorantagonist en algemene aanvalsuitlokker in diverse diermodellen voor insulten en epilepsie.

Let op dat de tip of de kop van de worm van links naar rechts zwaait tijdens het foerageren. In deze video tonen we een andere worm van dezelfde synaptische transmissie-mutantstam die in de vorige video werd gebruikt. Merk op dat deze worm, die zich in de aanwezigheid bevindt van 2,5 mg PTZ per ml water, zijn kop grotendeels blijft van links naar rechts bewegen tijdens het foerageren.

Toch stopt deze worm af en toe met het van zijde naar zijde foerageren en stuwt hij in plaats daarvan herhaaldelijk zijn anterieure gedeelte naar voren. Ten slotte moet men een worm zien die dezelfde mutatie draagt als de wormen in de vorige twee video's in aanwezigheid van 10 milligram PTZ per milliliter water. Merk op dat deze worm een verminderde zijwaartse foerageeractiviteit vertoont en zijn anterieure gedeelte met een hogere frequentie en intensiteit naar voren stuwt dan bij de lagere concentratie PTZ.

Deze resultaten tonen de dosisafhankelijkheid van PTZ aan, wat we observeren bij alle PTZ-gevoelige mutanten voor synaptische transmissie. Belangrijk is dat blootstelling aan PTZ onvoldoende is om epileptische convulsies op te wekken bij wildtype wormen. Evenzo hebben we geprobeerd, maar niet geobserveerd, PTZ-geïnduceerde epileptische convulsies bij wormen met specifieke tekortkomingen in de cholinerge transmissie, zoals on four, of wormen met een overmatige cholinerge transmissie, zoals tomasin one.

Daarom zou het mogelijk moeten zijn om mutanten voor synaptische transmissie met aldecarb-resistentie verder te karakteriseren op basis van hun relatieve gevoeligheid voor PTZ, om zo onderscheid te maken tussen tekortkomingen in de algemene synaptische functie of specifieke tekortkomingen in de cholinerge transmissie. Wellicht verrassend vertoont de ONC 25-mutant, met een sterke functionele reductie en zonder detecteerbare GABA-expressie in de inhiberende motorneuronen van C. elegans, geen spontane epileptische convulsies zoals in deze video te zien is.

Een ONC 25-mutant bij 10 milligram PTZ per milliliter water vertoont robuuste tonisch-clonische convulsies; hoewel niet getoond, gingen alleen anterieure convulsies met enige beweging vooraf aan de met ONC 25 geassocieerde tonisch-clonische convulsies, wat de convulsies van synap Bren one-mutanten nabootste. Daarom moet een experimentator er niet vanuit gaan dat alle inhiberende GABA-mutanten tonisch-clonische convulsies of nauw verwante tonische epileptische activiteit zullen vertonen in de aanwezigheid van PTZ, zeker gezien de waarschijnlijkheid van het verkrijgen van hypomorfe mutantallelen.

Nu we hebben aangetoond dat inhibitore GABA-mutanten hypersensitief zijn voor alde carb en voor PTZ, maar dat mutanten met een gebrekkige negatieve regulatie van de cholinerge transmissie alleen hypersensitief zijn voor alde carb en een normale sensitiviteit voor PTZ vertonen, kan men zich afvragen hoe UNC 43 loss-of-function mutanten reageren op PTZ, aangezien zij net als onze andere synaptische transmissiemutanten hypersensitief zijn voor Alda carb. Op 43-mutanten vertonen geen evidente epileptische convulsies in afwezigheid van PTZ, hoewel deze mutanten wel zeldzame, niet-repetitieve, maar nog steeds spontane volledige lichaamscontracties hebben; toch vertonen 43 loss-of-function mutanten na blootstelling aan 10 milligram PTZ per milliliter water robuuste, repetitieve en dosisafhankelijke volledige lichaamsconvulsies. Op dit moment zijn deze resultaten ambigu, maar ze lijken erop te wijzen dat on 43 geen specifieke rol moet hebben in de inhiberende GABAerge transmissie of een rol uitsluitend in de negatieve regulatie van de neurotransmitterafgifte.

In het zenuwstelsel van C. elegans hebben we zojuist aangetoond hoe men synaptische transmissiemutanten van C. elegans kan karakteriseren met complementaire neurale stimulantia: aldecarba, een cholinesteraseremmer, en PTZ, een GABA-receptorantagonist. Wanneer men een complementair farmacologisch paradigma volgt, dient men eraan te denken dat de mate van gevoeligheid voor de ene neurale stimulant de mate van gevoeligheid voor de andere neurale stimulant niet kan voorspellen. Het gebruik van aldecarb-assays zou moeten helpen bij het onderscheiden van inhibitieve GABA-mutanten, die head-bobben bij PTZ maar hypersensitief zijn voor aldecarba, van mutanten met een algemeen defecte synaptische functie, die ook head-bobben bij PTZ maar resistent zijn voor aldecarba. Bovendien moet men beseffen dat inhibitieve GABA-mutanten head-bobben bij PTZ, terwijl wormen die een negatieve regulatie van de cholinerge transmissie missen, een wild-type uiterlijk vertonen bij PTZ.

Daarom zou de PTZ-assay ook kunnen worden ingezet om onderscheid te maken tussen deze klassen van synaptische transmissiemutanten, die beide hypersensitief zijn voor Alde carb. Samenvattend zou een complementaire aanpak met PTZ- en Alde carb-assays een experimentator in staat stellen om synaptische transmissiemutanten van C elegant te karakteriseren op een manier die met geen van beide middelen afzonderlijk mogelijk is. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.