Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

Hallo, mijn naam is Manuel Ruiz Rubio van de afdeling Genetica van de Universiteit van Córdoba in Spanje. We gebruiken C. elegans als experimenteel instrument bij de studie naar autisme, waarbij we profiteren van het volledig gekarakteriseerde zenuwstelsel van C. elegans. We bestuderen mutanten van de nematode die defect zijn in genen die betrokken zijn bij de neurale synaps en die in verband zijn gebracht met autisme.

Neurexinen en neuroliginen zijn membraanadhesiemoleculen die aanwezig zijn in de synaps. De kop van C. elegans bevat de amphid, een zintuiglijk orgaan van de nematode dat responsen op verschillende stimuli medieert, waaronder osmotische sterkte. De amphid bestaat uit 12 sensorische bipolaire neuronen met gecilieerde dendrieten en één presynaptisch terminaal axon.

Twee van deze neuronen, ASHR en ASHL genoemd, zijn bijzonder belangrijk voor de osmotische sensorische functie bij het detecteren van wateroplosbare afstotingsstoffen met een hoge osmotische sterkte. Hiernaast wordt een methode beschreven om osmotische vermijding te meten in synaptische defecte mutanten van C. elegans.

Om de implicaties van neurexine en neuroligine bij het vermijden van een hoge osmotische sterkte te evalueren, hebben we de verschillende respons van C. elegans mutantstammen met defecte nrx-1 en nlg-1 genen gerapporteerd, gebruikmakend van een methode gebaseerd op een 4 M fructose-oplossing. Bereid op de dag van het experiment een 4 M stockoplossing van fructose voor met 1% Congo-rood en laat dit volledig oplossen bij kamertemperatuur. Een ring van één centimeter diameter wordt in het centrum van het vaste medium op een NGM-plaat aangebracht.

Gebruik 15 µL van de rode 4M fructose-oplossing. Laat de fructose ongeveer vijf minuten in de agar trekken; het experiment moet blind worden uitgevoerd. De plaat met elke stam die getest moet worden, dient door een tweede experimentator te worden gelabeld.

De SA wordt uitgevoerd met behulp van deze markeringen die niet zijn aangevraagd. Wanneer het experiment is beëindigd, ongeveer 24 uur voordat de verkoop plaatsvindt, is het noodzakelijk om L4-larven van elk genotype te selecteren en deze over te brengen naar een AFL NGM-plaat met e coli-bacteriën en deze de volgende dag bij 20 °C te bewaren. Het experiment dient te worden gestart met jonge volwassenen.

Plaats individuele wormen van elke stam binnen de rustcirkel en volg elk dier om de responstijd op de tic-barrière te timen. Er moeten 10 dieren van elke stam worden gebruikt en minimaal drie replica-experimenten worden uitgevoerd om tot een conclusief resultaat te komen. Dieren die de rode ring zes keer achter elkaar vermijden, worden geclassificeerd als normaal.

Dieren die de ring in minder dan zes pogingen verlaten, worden beschouwd als defect in de osmotische gevoeligheid; in elke SA moet een controlestam worden gebruikt en twee dieren worden gebruikt als positieve controles omdat zij de ringbarrière vermijden. Controlestammen reageren door achteruit te gaan wanneer zij een osmotische barrière van vier molar fructose tegenkomen. Neuro-deficiënte mutanten vertonen een vergelijkbaar gedrag met betrekking tot dit type sterkte.

Echter slaagden NEUR-deficiënte mutanten er niet in om deze osmotische barrière te detecteren. Dubbele mutanten met verschillende actieve neur- en nout-allelen herstelden het wildtype-fenotype dat reageerde op de osmotische sterkte. Om wormen via RNA-interferentie-voeding uit te schakelen, worden kolonies van E. coli HD115 geïsoleerd, een stam die is getransformeerd met de L4440-vector die een fragment bevat dat overeenkomt met het doelgen. Bacteriën worden geïsoleerd op LBA- of carbon-platen voor de volgende dag.

Selecteer een bacteriekolonie en inoculeer LV vloeibaar medium. Laat dit ongeveer zeven uur groeien onder schudcondities bij 37 °C. Druppel deze cultuur op een NGM-plaat met carbonic ceiling en IPTG en laat dit een nacht bij kamertemperatuur staan, zodat de bacteriën kunnen groeien en de inductie van de expressie van het fragment van het doelgen kan beginnen.

Het is noodzakelijk om een positieve en een niet-negatieve controle te gebruiken voor RNA-interferentie. Voedingsexperimenten. De negatieve controle is gelijk.

HT115-stammen getransformeerd met de pL4440-vector. De positieve controles zijn HT115-cellen getransformeerd met de pL4440-vector die een sequence van het unc-22-gen bevat. De knockdown van dit gen veroorzaakt een 'shaking'-fenotype dat gemakkelijk onder de stereomicroscoop te onderscheiden is.

De eerste dag. Vier L4-stadia van NGM PLA met bacteriën worden overgebracht naar een plaat met bacteriën en bewaard op 20 °C gedurende 12 uur. Dit is een vastenperiode.

Verplaats de volgende dag de jonge volwassenen in het snelle stadium naar een plaat die is geïnoculeerd met bacteriën die het specifieke doelgen voor RNA-interferentie tot expressie brengen. Laat deze ongeveer 48 uur bij 20 °C staan om de F1-nakomelingen te verkrijgen. Selecteer vervolgens gedurende de volgende twee dagen enkele F1-volwassen wormen en plaats deze op een andere plaat die is geïnoculeerd met dezelfde bacteriën.

Selecteer en isoleer jonge volwassenen uit het F2-nageslacht bij de fenotypering van de Bristol N2 wild-type stam gevoed met bacteriën. L4 40 vectoren bewogen achteruit bij de osmotische barrière.

De Bristol en true white typestam, gevoed met bacteriën die een fragment van het nrx-1-gen uit C. elegans tot expressie brachten, slaagde er niet in om 4M oplossingen te detecteren. Echter, de nrx-1-deficiënte mutant, die niet in staat was de osmotische barrière te detecteren, herstelde deze capaciteit toen deze werd gevoed met bacteriën die een fragment van het nrx-1-gen uit C. elegans tot expressie brachten. In deze video tonen we een eenvoudige methode waarmee het effect van genen die de osmotische vermijdingsrespons in C. elegans beïnvloeden, bestudeerd kan worden.

Een ring van fructose verzadigd met Congo Rood wordt gebruikt om de respons van de nematode op osmotische sterkte te analyseren. Neuroligin-deficiënte mutanten vertonen gebreken in deze respons; echter, nrx-mutanten zijn niet belemmerd in het detecteren van osmotische stress en vertonen een respons die vergelijkbaar is met die van het wild-type stam. Deze video laat zien dat dubbele mutantstammen met verschillende knockout-allelen in de nrx- en nlg-genen het wild-type fenotype herstelden in hun respons op osmotische sterkte.

Deze waarnemingen werden bevestigd met behulp van RNA-interferentie via een feeding lockdown-benadering. Op deze manier was de wildtype-stam minder in staat om de osmotische barrière te herkennen wanneer deze werd gevoed met bacteriën die de overeenkomstige sequentie van het ING-gen tot expressie brachten. Aan de andere kant herstelden neur-defecte mutanten, die niet in staat zijn de 4M fructose-oplossing te detecteren, dit gedrag wanneer zij werden gevoed met bacteriën die de overeenkomstige sequentie van het NNU-gen tot expressie brachten.

De resultaten die in dit experiment worden getoond, geven aan dat nrx-1 en nlg-1 betrokken kunnen zijn bij de synaptische verbinding van de sensorische neuronen van de nematode en ook dat ze met elkaar interageren op een manier die de synaptische functie beïnvloedt. Oké, tot ziens en veel succes met uw experimenten.