Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Mijn naam is Maria en ik werk bij Y Healthcare in NOS in Zweden. Celoppervlakte-eiwitten zijn vaak betrokken bij de communicatie tussen cellen en hun omgeving en zijn daarom van bijzonder belang in onderzoek dat erop gericht is meer inzicht te krijgen in ziekten en andere biologische variaties die worden veroorzaakt door veranderingen in de celomgeving. In deze video laat ik u een eenvoudig protocol zien voor de labeling van het celoppervlak via de side-eye dodge methode, waarmee u deze eiwitten met een lage abundantie visueel kunt verrijken zonder fysieke versterking, om vervolgens de verschillen tussen deze celoppervlakte-eiwitten met deze technologie te bestuderen.

Als u deze technologie interessant vindt, kunt u meer informatie vinden in het 2D-handboek. Bovendien hebben we een applicatienota over dit specifieke onderwerp die u kunt downloaden van job. In het protocol voor celoppervlaklabeling dat bovenaan wordt getoond, labelt u de cellen terwijl ze nog intact zijn. Tijdens het labelingsproces heeft de kleurstof alleen toegang tot de eiwitten op het celoppervlak.

Na de labelingsstap worden de cellen geanalyseerd om de specifieke labeling van het celoppervlak te verifiëren. Het gelabelde monster werd gefractioneerd in membraan- en cytosolische eiwitten. Parallel daaraan werd een niet-gefractioneerd monster voorbereid.

Ter vergelijking is deze fractioneringsanalyse niet noodzakelijk, maar is deze hier uitgevoerd om aan te tonen dat het celoppervlakprotocol specifiek is voor celoppervlak-eiwitten. We hebben ook het standaard ETH-protocol voor labeling zonder dieet uitgevoerd, zoals hieronder te zien is; de cellen worden vóór de labeling gelyseerd, waardoor alle cellulaire eiwitten toegankelijk zijn voor labeling. Na de labelingstap worden de monsters onderworpen aan 2D-elektroforese.

Adherente cellen worden losgekoppeld met een niet-enzymatische procedure om digestie van de doelluwe celoppervlakte-eiwitten te voorkomen. In dit protocol gebruiken we een rubberen politieagent, maar het gebruik van enzyme-free cell dissociation media is ook een optie. Tel de cellen en verdeel de celsuspensies in aliquots van 5 tot 10 miljoen cellen per buis. De cellen worden vervolgens gecentrifugeerd en gewassen in HPSS pH 7.4 om sporen van het celkweekmedium te verwijderen.

Media-contaminatie door serumproteïnen en fluorescerende componenten kan de labelings- en detectiestappen verstoren. Cellen die in suspensie groeien, worden direct gecentrifugeerd tot een pellet en gewassen vóór de labelingsstap na het wassen. De celpellet wordt geresuspendeerd in 200 µL ijskoud labelingsbuffer bestaande uit HPSS pH 8.5 en één molar ureum.

Controleer voor optimale labelingscondities van celoppervlakte-eiwitten altijd de pH. Voor de labeling gebruikten we 600 picomol side-eye voor 10 miljoen CHO-cellen. De optimale verhouding tussen side-eye en het aantal cellen varieert afhankelijk van het celtype.

Aangezien de exacte proteïneconcentraties op het celoppervlak onbekend zijn, wordt de methode voor het bepalen van de optimale condities voor side-eye labeling van proteïnen beschreven in het handboek voor principes en methoden van 2D-elektroforese. De cellen worden 20 minuten op ijs in het donker geïncubeerd met side eye D floor, minimal dice.

Na de labelingsreactie wordt de niet-reagerende kleurstof geneutraliseerd door het toevoegen van 20 µL 10 mM lysine. De gelabelde cellen worden vervolgens twee keer gewassen in koud HPSS-buffer pH 7.4 om de overtollige kleurstof te verwijderen. Hierdoor blijft er geen vrije kleurstof over voor ongewenste intracellulaire labeling of eiwitbinding in de volgende stap, namelijk de cellyse.

De eiwitten op het celoppervlak zijn nu gelabeld en de cellen zijn gewassen en klaar om te worden gelyseerd. De pellet van de laatste wasstap wordt geresuspendeerd in 150 µL koude lysisbuffer bestaande uit 7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesiumacetaat pH 8,5 en gedurende ten minste één uur op ijs bewaard met af en toe vortexen. De monsters zijn nu klaar voor 2D-scheiding.

De eerste stap bij de elektrolyse is het voorbereiden van de IPD-strips voor rehydratie. Bereid de rehydratieoplossing voor door IPG-buffer toe te voegen die overeenkomt met het pH-interval van de gebruikte strips, en voeg de oplossing toe aan het reservoir van de rehydratieschaal. Verwijder de beschermfolie van de IPG-strip en plaats de strips voorzichtig met de gedroogde gel naar beneden in de rehydratieschaal met de rehydratieoplossing.

Sluit het deksel van de IPG-box en laat de strips een nacht rehydrateren. In de eerste dimensie, isoelektrische focusering, worden de eiwitten gescheiden op basis van hun pi. Dit wordt uitgevoerd met behulp van de IPG four three.

De gerehydrateerde strips worden in het manifold geplaatst en de elektrode wordt bovenop gemonteerd. Van elk monster werden 50 micrograms aangebracht met behulp van monsterapplicatiedoppen. We hebben ofwel direct niet-gefractioneerde monsters aangebracht zonder voorafgaande fractionering, ofwel de monsters gefractioneerd in membraan- en cytosolische fracties voordat ze werden aangebracht.

Het lood is gesloten om de fluorescerende monsters tegen licht te beschermen. Het instrument is volgens de aanbeveling geprogrammeerd en gedurende de nacht uitgevoerd. Grote 12%lamby gels zijn gekost met behulp van adult 12 gel.

Coster-verdrijvingsvloeistof werd toegevoegd om polymerisatie van acrylamidegels in de slangetjes te voorkomen. De gels kregen de tijd om gedurende de nacht bij kamertemperatuur te polymeriseren vóór gebruik. Na de isoelektrische focussering worden de strips verwijderd en geëquilibreerd in een SDS-bevattende buffer in twee stappen: eerst met DTT om de disulfidebruggen van cysteïneresten te reduceren, gevolgd door alkylering met iodoacetamide om modificatie door acrylamide te voorkomen.

De IPG-strips worden gedoopt in running buffer en voorzichtig bovenop de grote tweedimensionale gels geplaatst. Voorkom dat er luchtbellen tussen de strips en de gel opgesloten raken door er een gesmolten 2% agro-oplossing met bromfenolblauw bovenop aan te brengen. De gels zijn nu klaar voor de tweede dimensie SDS-PAGE-scheiding in de tweede dimensie SDS-PAGE.

De eiwitten worden gescheiden op basis van molecuulgewicht met behulp van een tonal six-systeem. Vul de elektroforesekamer met anodische loopbuffer, plaats de gels en vul het bovenste compartiment met kathodische loopbuffer. Stel de voeding in volgens de aanbevelingen en laat de tweede dimensie gedurende ongeveer vier tot vijf uur lopen, beschermd tegen licht, of totdat het kleurfront de onderkant van de gel bereikt.

Na de tweedimensionale elektroforese worden de gelcassettes met behulp van de grijpers in de Typhoon fluorescentie-imager geplaatst. Twee gels en drie kanalen kunnen gelijktijdig worden gescand. Het resultaat van deze 2D-DL vertoont een hoge resolutie van membraaneiwitten in het monster, ondanks enkele bekende beperkingen bij de detectie van hydrofobe eiwitten in 2D-DL. De resulten laten veel nieuwe spots van celoppervlaklabeling zien, hier in rood weergegeven, die niet worden gedetecteerd met het standaard labelingsprotocol, hier in groen weergegeven.

Deze resultaten tonen aan dat het protocol voor celoppervlaklabeling zeer specifiek is voor het labelen van celoppervlakte-eiwitten. Omdat uitsluitend celoppervlakte-eiwitten worden gelabeld, zijn deze gemakkelijker te visualiseren en wordt attenuatie door overvloedige cytosolische eiwitten vermeden. De fluorescentie-afbeelding van gels met een niet gefractioneerde membraanfractie of cytosolische fractie wordt bovenaan getoond.

Hieronder staat een afbeelding van dezelfde gel na kleuring met zilver. De resultaten tonen geen fluorescente markering van cytosolische eiwitten, maar de zilverkleuring laat zien dat er wel eiwitten in de gels aanwezig zijn. De resultaten tonen bovendien soortgelijke spotmap-patronen voor de niet-gefractioneerde en membraanfracties, wat aantoont dat fractionering voorafgaand aan de 2D-elektroforese niet nodig is, waardoor dit protocol zowel eenvoudig als praktisch is.

SI twee, SI drie en SCI vijf vertonen vergelijkbare labelingspatronen en zijn allemaal compatibel met het protocol voor celoppervlakken. Er werd een dieetexperiment uitgevoerd met alle drie de side eye DI floor minimal dy om de differentiële expressie van celoppervlakte-eiwitten in CHO-cellen te bestuderen na serumstarvatie gedurende verschillende tijdsintervallen. CY twee celoppervlakte-monsters van alle monsters in het experiment werden samengevoegd en gebruikt als interne standaard.

De differentiële veranderingen van verschillende celoppervlakte-eiwitten konden tijdens de uithongeringsperiode worden gevolgd. Met het celoppervlakte-protocol werden meer dan 18 nieuwe membraaneiwitten gedetecteerd die niet waren aangetroffen met het standaardprotocol voor het identificeren van de eiwitten in de preparatieve gel. Het was noodzakelijk om de celoppervlakte-monster te spiken om de koppeling terug naar de spots in de analytische dataset te vergemakkelijken.

De resultaten tonen een hoge resolutie van een groot aantal celoppervlakte-eiwitten. Dit protocol is zeer specifiek voor celoppervlakte-eiwitten en er was geen labeling van intracellulaire eiwitten zichtbaar.

Met deze methode kunt u meer celoppervlakte-eiwitten detecteren in vergelijking met een standaardprotocol, en zoals u al heeft gezien, is het een zeer eenvoudig protocol om uit te voeren. U labelt simpelweg uw celoppervlakte-eiwitten terwijl deze nog intact zijn en analyseert ze direct via 2D-elektroforese zonder membraanfractionering. Dit is dus een zeer goed protocol om celoppervlakte-eiwitten en de verschillen daarvan met de D-technologie te bestuderen.