Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen
22 oktober 2008
Dit is een gids voor het wijzigen van de vorm van glas micropipetten. In het bijzonder door gebruik te maken van warmte en luchtdruk van de taper is verbreed zonder verhoging van de tip opening, wat leidt tot een lagere weerstand pipet. Dit is essentieel voor het lage geluidsniveau opnamen van kleine cellen te verkrijgen, maar is nuttig in tal van toepassingen.
Deze procedure begint met het positioneren van de pipetpunt nabij de polijstfilament bij een vergroting van 100x. Zet vervolgens de luchtdruk en de verwarming in. Het filament.
De pipetpunt zal uitzetten om een stompe punt te vormen. Schakel de verwarming uit om een kleinere opening van de punt te verkrijgen. Schakel de druk en de verwarming opnieuw uit.
Hallo, ik ben Brandon Johnson uit het laboratorium van Dr. Miriam Goodman van de afdeling Moleculaire en Cellulaire Fysiologie aan de Stanford University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het drukpolijsten van patchpipetten. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om ionkanalen en membraanpatches in C. elegans-neuronen te bestuderen.
Laten we beginnen. Pak een set van zes tot 10 patchpipetten. Raadpleeg een lokale expert of ons gevisualiseerde experiment over het maken van patchpipetten en scherpe elektroden met een programmeerbare polar voor hulp.
Om de procedure te starten, stelt u de druk van de persluchtleiding in op ongeveer 40 PS.I en verbindt u de persluchtleiding vervolgens met een vierwegregelklep. Sluit een stuk plastic slang aan op de vierwegklep en bevestig een hogedrukpipethouder aan het vrije uiteinde van de plastic slang. Gebruik een micro-smederijopstelling om het polijsten uit te voeren.
We maken gebruik van de Ccpm two-kit van LA Scientific. Deze opstelling beschikt over een hogedrukpijpethouder, een platina verwarmingselement dat via een voetpedaal wordt bediend en een microscoop uitgerust met objectieven met een lage en hoge vergroting van 10x en 100x en een lange werkafstand; dit is essentieel om de opening van de pipet tijdens het protocol te kunnen observeren.
Controleer vervolgens of het drukventiel in de uit-stand staat. Plaats daarna een pipet in de pipethouder en draai de fitting handvast aan voor de veiligheid in het laboratorium. Zorg ervoor dat de pipet stevig in de pipethouder is vastgezet.
Anders zal de luchtdruk ervoor zorgen dat de pipet uit de houder wordt gestuwd. Als optionele stap kunt u de pipet coaten met een hydrofoob isolatiemateriaal, zoals wax, om de capaciteit te verlagen en de ruiseigenschappen te verbeteren. Plaats nu de pipethouder in de micro forge en positioneer de pipethouder op de objecttafel van de microscoop, zodat zowel de tip als de polijstfilament zichtbaar zijn bij een lage vergroting van 10 keer op de micro forge.
Breng de tip tot ongeveer 50 micron van de filament, schakel vervolgens over naar het 100 Objectief met hoge resolutie; zowel de pipetpunt als de polijstfilament moeten in focus en in het gezichtsveld zijn. Pas indien nodig de hoogte van de filament aan. Omdat de positie van de pipet niet kan worden aangepast, moeten de pipetpunt en de filament zich aan tegenovergestelde zijden van het gezichtsveld bevinden.
Zorg ervoor dat de pipetpunt niet te dicht bij de filament wordt geplaatst, omdat deze uitzet tijdens het verhitten en tegen de pipet zou kunnen stoten. Zodra de punt en het filament correct zijn gepositioneerd, draait u aan de klep om perslucht in de pipet te leiden en verhit u de pipetpunt totdat het taps toelopende gedeelte achter de punt begint uit te zetten. Stop het verhitten voordat de punt te sterk uitzet.
Experimenteren is noodzakelijk om de juiste afstand, hitte en tijd voor de gewenste vorm te bepalen. Als optionele stap kunt u de punt ook polijsten zonder druk uit te oefenen om de diameter van de puntopening te verkleinen. Houd er daarnaast rekening mee dat deze polijststappen kunnen worden herhaald voor een fijnere afwerking.
Pas zowel de vorm als de afmetingen van de pipetpunt aan. Wanneer het polijsten voltooid is, schakelt u het drukpunt uit en richt u de pipetpunt in een veilige richting.
Verwijder de pipet en plaats deze in een schone bewaarbox om stofvorming te voorkomen. Voor de veiligheid in het laboratorium dient u ervoor te zorgen dat de druk is uitgeschakeld voordat u de pipet verwijdert. Anders kan deze uit de pipethouder worden geschoten.
Na verwijdering hebben we u zojuist gedemonstreerd hoe u pipetten via drukpolijsten kunt behandelen voor verbeterde patch clamp-registraties. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de polijstspiraal te coaten met glas met een hoog smeltpunt, om de afzetting van vervluchtigd metaal op de pipetten te minimaliseren. Daarnaast dient u voorzichtig te zijn wanneer de pipetten zijn blootgesteld aan perslucht.
Zorg ervoor dat de pipette stevig in de houder is geplaatst en schakel de luchttoevoer uit voordat u de pipette uit de houder verwijdert. Dat is alles. Bedankt voor het kijken.
Veel succes met het drukopstoppen en met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze handleiding beschrijft in detail de aanpassing van de vorm van glazen micropipetten met behulp van hitte en luchtdruk. Dit proces maakt het mogelijk om de tapsheid te verbreden zonder de opening van de tip te vergroten, wat essentieel is voor het verkrijgen van opnames met een lage ruis bij toepassingen in kleine cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Fabricage van micropipetten
Achtergrond
- Glazen micropipetten zijn essentiële instrumenten bij elektrofysiologische registraties.
- Een lagere pipetweerstand is noodzakelijk voor registraties van hoge kwaliteit.
- Het aanpassen van de vorm kan de prestaties in diverse toepassingen verbeteren.
- Deze techniek is bijzonder nuttig voor registraties in kleine cellen.
Doel van de studie
- Om een methode te bieden voor het vormen van glazen micropipetten.
- Om de weerstand van de pipet te verminderen zonder de opening van de tip te vergroten.
- Om de kwaliteit van opnames van kleine cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het positioneren van de pipetpunt nabij een polijstfilament bij een hoge vergroting.
- Het toepassen van luchtdruk en warmte om de pipetpunt uit te zetten.
- Het uitschakelen van de warmte om een kleinere opening van de punt te verkrijgen.
- Definitieve aanpassingen door de druk en warmte uit te schakelen.
Belangrijkste resultaten
- De pipetpunt kan effectief worden omgevormd tot een stompe vorm.
- Er wordt een lagere weerstand bereikt zonder de puntgrootte te vergroten.
- Deze methode verbetert de registratiekwaliteit van kleine cellen.
- Demonstreert een praktische aanpak voor de modificatie van micropipetten.
Conclusies
- Het vormen van glazen micropipetten is een waardevolle techniek in neurowetenschappelijk onderzoek.
- Een verbeterd pipetteontwerp leidt tot een betere datakwaliteit.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse elektrofysiologische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het polijsten van pipetten onder druk vermindert de elektrische weerstand bij patch-clampmetingen zonder de tipdiameter te veranderen, waardoor ionkanaalmetingen met een hogere getrouwheid mogelijk zijn bij kleine neuronale populaties. Deze technische verbetering ondersteunt de validatie van targets bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen door de signaal-ruisverhouding in elektrofysiologische assays te verbeteren. Een verbeterde opnamekwaliteit verhoogt het voorspellend vertrouwen in vroege mechanistische studies naar neuronale exciteerbaarheid en synaptische functie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de ionkanaalfunctie in neuronen met een kleine diameter, die cruciaal zijn als doelwitten voor neuropathische pijn en epilepsie.
- Operationele waarde: Vermindert de variabiliteit in single-channel registraties door pipette-geïnduceerde ruis te minimaliseren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde pipetgeometrieën voor reproduceerbare elektrofysiologische screeningspanels.
- Operationele waarde: Compatibel met zowel zachte als harde glazen micropipetten, wat een flexibel assay-ontwerp over verschillende doelklassen mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt toepassingen van de geperforeerde patchclamp door stompe tips te genereren die de vorming van membraanblebs verhogen bij antibiotische perforanten.
- Operationele waarde: Verlengt de registratieduur in primaire neuronale culturen, waardoor de doorvoer voor lead-optimalisatiestudies wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen vroege discovery-workflows, waarbij elektrofysiologische fenotypering dient als basis voor de selectie van targets en het profileren van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Maakt functionele validatie van ionkanaaltargets in ziekterelevante neuronale modellen mogelijk.
- Screening: Levert pipetten met een lage weerstand voor high-fidelity screening van verbindingen in patch-clamp platforms.
- Analytics: Genereert kwantitatieve stroom- en conductiemetingen met verbeterde signaalstabiliteit.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert longitudinale registratie in acute coupes en gekweekte neuronen voor farmacokinetische-farmacodynamische modellering.
- Enterprise Reuse: Vereist slechts een microforge-upgrade, waardoor het een schaalbare, kosteneffectieve verbetering is van de bestaande elektrofysiologische infrastructuur.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door zuiverdere elektrofysiologische fenotypes.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays tussen locaties en operators door de pipettegeometrie te standaardiseren.
- Strategische waarde: Vermindert fout-negatieven bij ionkanaalscreening door technische ruis te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen in preklinische programma's gericht op neuronale exciteerbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van micropipetten en elektrofysiologie.
- Vereist een microforge met hogedrukklep, verwarmingsfilament en vergrotende optiek.
- Vraagt om standaardisatie van druk-, hitte- en tijdparameters tussen gebruikers.
- Houd rekening met verschillen in glastype (soda-lime versus borosilicaat) bij de polijstrespons.
- Beperkt door de noodzaak van handmatige positionering van de tip en de vaardigheid van de operator om overexpansie te voorkomen.
