Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Glazen capillaire pipetten zijn alomtegenwoordig geworden in laboratoria voor een breed scala aan technieken, zoals electroporatie van enkelvoudige cellen, DNA-microinjectie en patchclamp-elektrofysiologie. Om glazen capillaire patchclamp-elektroden voor registraties voor te bereiden, wordt silicaatglas uitgetrokken op een programmeerbare puller. De elektrotips worden gecoat met was, waarna de tips vlamgepolijst worden en worden bewaard voor toekomstig gebruik. Hallo, ik ben Miriam Goodman van de afdeling Moleculaire en Cellulaire Fysiologie aan de Stanford University.

In deze video demonstreer ik hoe u patchclamp-pipetten en scherpe elektroden maakt voor elektrofysiologie. Glazen micro-elektroden, ook wel pipetten genoemd, zijn al decennia lang onmisbaar in de elektrofysiologie. Tegenwoordig worden deze pipetten gemaakt van glazen capillairen met behulp van een programmeerbare puller.

Laten we beginnen. Om patchclamp-pipetten te maken, gebruiken we Sutter borosilicaatcapillairen die schoon en stofvrij zijn, en we maken gebruik van de Sutter P-97 flaming ground micro-elektrode puller. Het Pipette Cookbook van Sutter is een uitstekende referentie voor het ontwikkelen van geschikte pullprogramma's.

Begin met het optillen van de stofkap van de puller. Neem vervolgens één glazen capillair uit de doos. Zorg ervoor dat u het deksel terugplaatst om stofophoping te minimaliseren.

Schuif vervolgens met één hand de capillair in de groef aan één zijde van de filament en draai de klem lichtjes aan. Op dit punt moet de klem strak genoeg zitten om te voorkomen dat de buis valt, maar los genoeg zodat u deze in de groef kunt schuiven. Laat nu de veerbeveiliging aan dezelfde zijde los.

Pak vervolgens met uw duim en wijsvinger de metalen lipjes vast die aan de onderkant van beide dragers zijn bevestigd. Laat de andere metalen veerstop los. Trek de dragers zo ver mogelijk naar elkaar toe en houd ze met één hand op hun plaats.

Schuif de buis vervolgens door de behuizing van het gloeidraad in de groef van de houder aan de overzijde. Vermijd het duwen van het glas tegen het gloeidraad. Draai de klemmen aan beide zijden vast.

Ze moeten strak genoeg zitten om de dragers op hun plaats te houden, maar niet zo strak dat het glas verbrijzelt. Sluit nu de stofkap en druk op de groene knop. Gemarkeerde pole-pipetten voor patchclamp-metingen worden gevormd met behulp van een vijfstaps-polprogramma met een afnemende temperatuur en snelheid bij elke stap en een kleine pole bij de laatste stap.

Dit programma maakt gebruik van hitte en zwaartekracht. De procedure voor het maken van scherpe elektroden is zeer vergelijkbaar, maar in dit geval gebruiken we de dunne glazen capillair van Warner Instruments met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 0,78 mm. Daarnaast passen we een trekprogramma toe dat, naast hitte en zwaartekracht, ook een motor gebruikt zodra de trekprogramma's zijn voltooid.

Til de stofkap op, draai beide klemmen los en verwijder de voltooide pipet. Plaats de pipetten vervolgens in een werkbak. De bak kan worden gemaakt door een strook schuimrubber aan het rek van een plastic pipetpuntendoos te lijmen en vervolgens zes tot acht inkepingen in het schuimrubber te snijden.

Plaats de pipetten in de sleuven. Zodra de doos gevuld is met getrokken pipetten, volgt de stap van het vuurpolijsten om de pipetten vuur te polijsten. Stel vóór het begin van het vuurpolijsten een micro-smeedinstallatie in met een platina verwarmingsfilament dat via een voetpedaal wordt bediend.

Bedek eerst de pipet met tandheelkundige was om de capaciteit te verlagen en de ruiskarakteristieken te verbeteren. Houd hiervoor een kleine hoeveelheid gesmolten was binnen handbereik. Oefen luchtdruk uit op de achterkant van de pipet om te voorkomen dat er was in de tip terechtkomt.

Doop vervolgens de tip kort in de vloeibare was. Verwijder deze daarna. Plaats de pipet in het polijstapparaat en breng de tip tot op ongeveer 50 microns van de filament.

Houd er rekening mee dat het filament uitzet bij verhitting. Pas een korte hittepuls van één of twee seconden toe om de was van de pipetpunt te verwijderen en het glas glad te maken. Controleer de pipetpunten onder een microscoop om de diameter van de opening en de gladheid te bepalen.

Voor standaard patchclamp-metingen moet de diameter van de tipopening één tot drie micron zijn; gooi ruwe, ongelijkmatige of onregelmatige tips weg. Plaats de voltooide pipet in een bewaarbox en zorg dat het deksel gesloten is om de pipetten tegen stof te beschermen; herhaal dit tot er 10 succesvolle pipetten zijn. Ik heb u zojuist laten zien hoe u patchclamp-pipetten en scherpe elektroden maakt met een programmeerbare puller.

Dezelfde procedure kan worden gebruikt om diverse glazen instrumenten te maken, waaronder injectienaalden voor optimale patchclamp-resultaten. Het is belangrijk om nieuwe stofvrije pipetten op de dag van het experiment te trekken en deze binnen een uur voor aanvang van het experiment te polijsten. Controleer daarnaast via visuele inspectie of de pipetten glad en gepolijst zijn.

Bekijk zeker ook onze andere video, waarin wordt gedemonstreerd hoe patch clamp-registraties worden uitgevoerd van ionkanalen die tot expressie zijn gebracht in opus-oocyten. Dat was het. Nu bent u een expert in het gebruik van pipetten en veel succes met uw experimenten.