Disekcja NMJ larw Drosophila
4 lutego 2009
Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.
Procedura rozpoczyna się od umieszczenia larwy w trzecim stadium rozwojowym na płytce sekcyjnej. W tylnym i przednim końcu larwy umieszcza się szpilki. Za pomocą nożyczek przecina się ciało larwy, a następnie przy użyciu pęsety usuwa się narządy wewnętrzne.
Na koniec w każdym rogu ścianki ciała larwy umieszcza się cztery kolejne szpilki, aby utrzymać ją w napięciu podczas utrwalania. Cześć, nazywam się Jonathan Brent i pochodzę z laboratorium Briana McCabe'a w Departamencie Fizjologii i Biofizyki Socjalnej na Columbia University College of Physicians and Surgeons. Dzisiaj przedstawimy procedurę sekcji larwy drosophila oraz MJ.
Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania rozwoju synaptycznego złącza nerwowo-mięśniowego. Zacznijmy zatem. Larwy Drosophila posiadają 30 mięśni na każdy półsegment, których rozmieszczenie w obrębie obwodowej ściany ciała jest znane.
Łącznie 35 neuronów ruchowych unerwia te mięśnie w wysoce stereotypowy sposób. Aby uzyskać dostęp do złącza neuromięśniowego (NMJ), konieczne jest uważne wypreparowanie każdej larwy przy użyciu odpowiedniej techniki sekcji. NMJ może być wykorzystywane do obrazowania, immunohistochemii lub elektrofizjologii.
Procedurę rozpoczynaj od naniesienia kropli buforu HL 3.1 na płytkę sekcyjną. Bufor przygotowuje się wcześniej i chłodzi na lodzie. Ostrożnie wyłów z boku fiolki poruszającą się larwę w stadium trzeciego końca (third end star larvae), używając dużych kleszczyków stalowych (SS).
Ruch wskazuje, że larwa nie weszła w stadium pocieczy. Umieść larwę stroną grzbietową do góry w kropli buforu na płytce sekcyjnej. Zimny bufor znieczuli larwę i unieruchomi ją. Używając pęsety, umieść szpilkę entomologiczną pomiędzy tylnymi sferami, a następnie wbij drugą szpilkę blisko ciemnych haczyków gębowych, tak aby larwa była rozciągnięta i gotowa do rozwarcia.
Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe poziome nacięcie w kierunku tylnego końca larwy. Wsuń jedno ostrze nożyczek w nacięcie i wykonaj cięcie wzdłużne w kierunku przedniego końca larwy. Następnie wykonaj nacięcia poziome na przednim końcu larwy, po lewej i prawej stronie szpilki.
Aby usunąć narządy, takie jak jelita, należy dodać kilka kropel buforu HL 3.1 do zwierzęcia; jelita i pozostałe narządy wypłyną do roztworu, skąd można je oddzielić od ciała za pomocą pęsety. Należy również usunąć układ tchawkowy wraz z pozostałymi narządami. Następnie należy odsłonić wewnętrzne mięśnie ciała, odchylając i przypinając płaty powstałe w wyniku nacięć.
Należy pamiętać o rozciągnięciu ścian ciała w płaszczyźnie poziomej i pionowej. Podczas przypinania płatów należy usunąć wszelkie pozostałe fragmenty organów i raz wypłukać.
Po dodaniu świeżego buforu HL 3.1 larwa jest gotowa do utrwalenia świeżo przygotowanym formaldehydem rozcieńczonym do 3,5% w 1x PBS; całkowicie zanurz larwy w utrwalaczu i odczekaj 25 minut. Po zakończeniu procesu utrwalania przemyj larwy dwukrotnie buforem HL 3.1 przez trzy minuty. Ostrożnie usuń szpilki, a następnie przenieś larwy do probówek 1,5 ml zawierających 1x PBS, jeśli jest to konieczne.
Larwy można przechowywać do dwóch dni w temperaturze 4°C. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy wykorzystać zdyssekowane larwy niezwłocznie. Prawidłowo zdyssekowana larwa drosofilowa składa się z kilku kluczowych elementów.
Po pierwsze, należy uważać, aby nie uszkodzić mięśni, w szczególności mięśnia szóstego, siódmego i czwartego. Po drugie, zwierzę musi być odpowiednio rozciągnięte. W przeciwnym razie złącze nerwowo-mięśniowe może być niedostępne lub nierozpoznawalne.
Tutaj można zobaczyć prawidłowo zdyssekowaną larwę. NMJ jest wyraźnie widoczna, a układ jest teraz gotowy do przeprowadzenia eksperymentów. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić dyssekcję larwy w obrębie przełyku w celu zbadania złącza neuromięśniowego.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować mięśnie w nienaruszonym stanie. Jeśli mięśnie zostaną uszkodzone, nie będzie możliwości zbadania złączy nerwowo-mięśniowych. To wszystko.
Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego. Procedura obejmuje precyzyjne rozmieszczenie szpilek oraz użycie nożyczek i pincet w celu przygotowania larw do dalszej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Immunohistochemia
Wstęp
- Larwy Drosophila są powszechnie wykorzystywane w badaniach neurobiologicznych.
- Złącze nerwowo-mięśniowe jest kluczowym obszarem badania przekazywania sygnałów synaptycznych.
- Właściwe techniki mikrodysekcji są niezbędne dla sukcesu obrazowania i analizy.
- Niniejszy protokół przedstawia standaryzowaną metodę dysekcji larw.
Cel badania
- Przygotowanie larw Drosophila do analizy immunohistochemicznej.
- Ułatwienie obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.
- Standaryzacja technik sekcji w celu zapewnienia powtarzalności badań.
Zastosowane metody
- Umieszczenie szpilek w celu stabilizacji larw podczas sekcji.
- Użycie nożyczek do otwarcia larw.
- Usunięcie narządów wewnętrznych za pomocą pęsety.
- Fiksacja ściany ciała do celów obrazowania.
Główne wyniki
- Prawidłowa dyssekcja umożliwia wyraźną wizualizację złącza nerwowo-mięśniowego.
- Ustandaryzowane metody zwiększają powtarzalność wyników w różnych eksperymentach.
- Ułatwia dalsze badania nad funkcją i rozwojem synaptycznym.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań w dziedzinie neurobiologii Drosophila.
Wnioski
- Disekcja larw Drosophila jest kluczowym etapem w badaniach neurobiologicznych.
- Właściwe techniki poprawiają jakość analiz immunohistochemicznych.
- Niniejszy protokół stanowi cenny zasób dla badaczy w tej dziedzinie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) larwy Drosophila służy jako genetycznie podatny model do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej, oferując wysoką dostępność oraz rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek. Niniejszy protokół sekcji umożliwia powtarzalne przygotowanie NMJ do dalszych zastosowań, takich jak obrazowanie, immunohistochemia i elektrofizjologia, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Poprzez zapewnienie zestandaryzowanej metody izolacji i wizualizacji struktur synaptycznych, technika ta zwiększa pewność prognostyczną w ocenie neurobiologicznych celów oraz wyjaśnianiu szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z funkcją synaptyczną i szlakami rozwoju neurologicznymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez wysokowierną wizualizację wzorców unerwienia mięśni przez neurony ruchowe.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę wpływu interwencji genetycznych lub farmakologicznych na morfologię i funkcję NMJ.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje standaryzowane systemy biologiczne do przesiewania związków, zapewniając spójny dostęp do połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ).
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar liczby i wielkości wypustek synaptycznych oraz lokalizacji białek jako odczytów fenotypowych.
- Skalowalność: Wspiera równoległe przetwarzanie larw w ramach kampanii przesiewowych o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modele zachowawczych mechanizmów synaptycznych, które można zastosować do walidacji celów w chorobach neurodegeneracyjnych i zaburzeniach nerwowo-mięśniowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia genetyczne u Drosophila z biologią synaptyczną ssaków poprzez zachowane szlaki sygnałowe.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Umożliwia wczesną ocenę oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków w żywym, nienaruszonym systemie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przepływ pracy z zakresu sekcji wpisuje się w wczesną fazę odkrywania poprzez umożliwienie testowania hipotez, prowadzi do identyfikacji wiodących cząsteczek za pomocą mierzalnych fenotypów synaptycznych i wspiera walidację przedkliniczną dzięki screeningowi fenotypowemu w odniesieniu do konkretnych chorób.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków synaptycznych i walidację funkcjonalną celów poprzez bezpośrednią wizualizację NMJ.
- Przesiewanie: Dostarcza preparaty gotowe do analizy z powtarzalnymi odczytami strukturalnymi i fluorescencyjnymi do oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe dane morfologiczne i immunohistochemiczne do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy mechanizmy synaptyczne Drosophila z modelami przedklinicznymi poprzez konserwatywne szlaki molekularne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny neurocelów w ramach wielu kampanii odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przygotowania NMJ pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki możliwości wczesnego wykrycia toksyczności synaptycznej lub zaangażowania celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów neurologicznych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o funkcjonalne wyniki synaptyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z Drosophila, mikrochirurgii oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Metoda wymaga użycia płytek sekcyjnych, szpilek entomologicznych, nożyczek sprężynowych, pęset oraz buforu HL 3.1.
- Niezbędna jest standaryzacja napięcia szpilek oraz warunków buforowych dla wszystkich użytkowników.
- W ramach dostosowania należy uwzględnić różne stadia larwalne oraz tła genetyczne wpływające na integralność mięśni.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymaganą sprawność manualną oraz ryzyko uszkodzenia mięśni w przypadku nieprecyzyjnej sekcji.
