Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3^rd stadium zasiedlenia

Transport aksonalny można badać poprzez wizualizację nerwów segmentarnych larwy. Larwa drosophila w trzecim stadium rozwojowym. W pierwszej kolejności przeprowadza się sekcję larwy, odsłaniając OUN bez uszkadzania płatów optycznych, zwoju brzusznego oraz nerwów segmentarnych.

Drugim krokiem procedury jest utrwalenie larwy w formaldehydzie przed inkubacją z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc oraz z przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w ciemności. Następnie larwę montuje się na szkiełku przedmiotowym, aby zbadać defekty transportu aksonalnego. Lokalizację oraz rozkład białek można przeanalizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w transport aksonalny, można ją również zastosować w innych układach, takich jak morfologia synaps i mięśni. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ na początku przeprowadzenie dopuszczalnej sekcji jest wymagające, zwłaszcza w zakresie zachowania nienaruszonych nerwów segmentowych mózgu oraz mięśni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować jednokrotny bufor utrwalający do sekcji, jednokrotny PBT oraz 5% BSA.

Zgodnie ze szczegółami zawartymi w tabeli przedstawionej przed sekcją, przygotuj czystą parę pęset nr 5, czystą parę nożyczek chirurgicznych o prostym ostrzu oraz piny, aby rozpocząć sekcję. Użyj mikrosyzyły, aby zebrać trzeci stadium larwy z określonym genotypem na szalkę Petriego. Następnie przemyj larwy w szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną, aby usunąć cały pokarm.

Następnie umieść larwę na szalce Straubem stroną grzbietową do góry. Przypnij larwę w części przedniej i tylnej. Na przypiętą larwę nanieś za pomocą pęsety kroplę jednorazowego buforu do sekcji.

Nacinamy kutykulę na linii środkowej grzbietu w pobliżu końca tylnego. Za pomocą nożyczek wycinamy kutykulę, prowadząc cięcie od końca tylnego do końca przedniego. Na rozciętą kutykulę nakładamy kroplę 1x buforu do sekcji.

Używając szpilki, chwyć jedną krawędź boczną kutykuli w pobliżu środka larwy i przytwierdź kutykulę kolejną szpulką. Drugą krawędź boczną kutykuli; po każdej stronie bocznej należy użyć dwóch szpilek, zgodnie z przedstawionym na schemacie. Następnie ostrożnie usuń jelito, ciała tłuszczowe i tchawki, pozostawiając jedynie mózg z dwoma płatami optycznymi i zwojami brzusznymi.

Po przytwierdzeniu nerwów segmentowych przeprowadza się fiksację i barwienie przeciwciałami, podczas gdy larwy pozostają przytwierdzone do naczynia ochronnego. Inkubuj wypreparowane larwy w 50 µL fiksatywa przez 30 minut. Wymieniając fiksatyw co 15 minut, po zakończeniu fiksacji przemyj larwy w jednokrotnym PBT przez 30 minut.

Wymieniając bufor co 10 minut, należy pamiętać, że larwy powinny być przez cały czas zanurzone w buforze. Przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając go do odpowiedniego stężenia w 5% BSA. Optymalne stężenia różnią się w zależności od stosowanych przeciwciał.

Przygotuj komorę wilgotną, wyścielając plastikową płytkę nasączonym wodą ręcznikiem KimWipe. Wymień go ostatni raz przy użyciu PBT.

Przepłukać przygotowanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4°C przez noc do następnego dnia. Przepłukać wypreparowane larwy w jednokrotnym PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Przygotować przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% roztworze BSA.

Następnie owiń komorę wilgotną folią, ponieważ niektóre przeciwciała wtórne są światłoczułe. Inkubuj larwy w roztworze przeciwciał wtórnych w temperaturze 25 °C przez godzinę. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi przemyj larwy w buforze PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut, a następnie przystąp do montowania i wizualizacji zdyssekowanych larw przed umieszczeniem ich na szkiełku.

Przygotuj preparat, nakładając dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku szkiełka, pozostawiając przestrzeń wystarczająco dużą, aby pomieścić szkiełko nakrywkę, zgodnie z przedstawionym na schemacie. Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia. W przestrzeni między pionowymi liniami lakieru na szkiełku nanieś kroplę buforu montażowego, jak pokazano na tym obrazie.

Preparat jest teraz gotowy do montażu. Wyjmij larwy po upływie czasu ostatniego zabarwienia PBT. Przepłucz je i delikatnie usuń piny boczne z larwy.

Należy uważać, aby nie przerwać kutykuli. Usuń dwa pozostałe piny, podnieś larwę pęsetą i umieść ją na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że larwa nie jest odwrócona i jest zorientowana stroną brzuszną do góry.

Delikatnie połóż szkiełko nakrywkę stroną górną do góry i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci, tak jak pokazano tutaj. Larwy są teraz gotowe do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ten reprezentatywny obraz przedstawia larwę typu dzikiego, zabarwioną przeciwciałami przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych – białku cystynowemu.

Nerwy segmentalne muchy lava są zabarwione jednorodnie. Tutaj mutant białka motorycznego lava został zabarwiony przeciwciałami przeciwko CSP. W nerwach segmentalnych widoczne są masywne akumulacje, które wykazują silne zabarwienie dla CSP.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu nerwów segmentowych przytwierdzonych do mózgu oraz o pozostawieniu mięśni w nienaruszonym stanie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu przeprowadzania sekcji. Utrwalcie trzecią partię do immunobarwienia i rozpocznijcie pracę z larwalnymi nerwami segmentowymi, aby badać transport aksonalny przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.