Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Procedura rozpoczyna się od przygotowania morpholino oraz mRNA z kapią otrzymanym w drodze transkrypcji in vitro. Mikropipetę napełnia się poprzez zasysanie roztworu zawierającego morpholino, a następnie kalibruje objętość iniekcji, korzystając z podstawki mikrometrycznej z pojedynczą komórką. Następnie zbiera się embriony danio pręgowanego i układa je w komorze do mikroiniekcji w celu wykonania mikroiniekcji w żółtko.

Roztwór roboczy wstrzykuje się do żółtka tuż poniżej komórki, a następnie wykorzystuje się ruchy cytoplazmatyczne do przetransportowania roztworu w celu mikroiniekcji do komórki. Po wykonaniu iniekcji wstrzyknąć roztwór do cytoplazmy komórki. Inkubować embriony w temperaturze 28,5 °C w medium E3 i oceniać występowanie interesujących fenotypów na kolejnych etapach rozwoju.

Witam, nazywam się Shiloh Yuen i reprezentuję laboratorium dr Sashy oraz Katedrę Genetyki w Yale University School of Medicine. Dzisiaj zaprezentujemy skuteczną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u rybek danio pręgowanych. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania roli rzęsek w torbielowatych chorobach nerek.

Zacznijmy zatem. Jednym z potężnych podejść w badaniach nad funkcją genów jest mikroiniekcja transkrybowanego in vitro RNA z czapką do embrionów ryb danio pręgowanych. W tej demonstracji przeprowadzimy mikroiniekcję transkryptu z tagiem EGFP i wykorzystamy ekspresję GFP w żywym, całym embrionie jako widoczny wskaźnik udanej iniekcji.

W pierwszej kolejności przeprowadzimy reakcję transkrypcji RNA z czapką in vitro dla badanego transkryptu. W naszym laboratorium rutynowo wstawiamy interesujący nas cDNA do wektora pCS2+, a następnie przeprowadzamy reakcję syntezy in vitro dużych ilości RNA z czapką, korzystając z zestawu mMessage mMachine SP6. Następnie oczyścimy próbkę RNA, przepuszczając ją przez zestaw RNeasy Mini lub stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową i precypitację izopropanolem.

Dokładnie określ stężenie preparatu RNA i przechowuj go w temperaturze -80 °C do momentu użycia w dniu iniekcji. Odmroź próbkę RNA, lekko wymieszaj w wortexie i krótko odwiruj. Następnie przygotuj roztwór roboczy w wodzie sterylnej o stężeniu końcowym czerwieni fenolowej od 0,025 do 0,05%; czerwień fenolowa służy jako widoczny marker iniekcji roztworu do zarodka.

W tym etapie przygotujemy roztwór roboczy mRNA EGFP o stężeniu 100 ng/µL z dodatkiem 0,05% czerwieni fenolowej. Na koniec należy przechowywać próbkę roboczą w lodzie, a zapas RNA przenieść do temperatury -80°C. Gdy nadejdzie czas wstrzyknięcia próbki, należy przystąpić do przygotowania morpho.

Antysensowne oligonukleotydy morphino są powszechnie stosowane do modyfikacji ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego białka lub modyfikację splicingu pre-mRNA. Morphino w danio pręgowanym służą jako potężne narzędzie genetyki odwrotnej do wyciszania funkcji genów. W niniejszym materiale przeprowadzimy mikroiniekcję morphino skierowanego przeciwko miejscu inicjacji translacji genu pkd2. Rutynowo stosujemy 300 M morphino, zaprojektowanego specjalnie dla badanego genu, pozyskanego z firmy Gene Tools LLC.

Następnie dodajemy 100 µL sterylnej wody, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 3 mM, po czym rozdzielamy go na alikwoty i przechowujemy w temperaturze -20 °C do momentu użycia w dniu iniekcji. Roztwór morino podgrzewamy w temperaturze 65 °C przez pięć minut. Następnie roztwór gwałtownie schładzamy na lodzie i krótko wirujemy; ten etap denaturuje wszelkie struktury drugorzędowe w oligosach i zapewnia całkowite rozpuszczenie substancji.

W następnym kroku przygotujemy roztwór roboczy poprzez rozcieńczenie roztworu Morpho w wodzie sterylnej do końcowego stężenia 0,025 do 0,05% czerwieni fenolowej. W tej demonstracji przygotujemy roztwór roboczy 0,5 mM PKD2 morino z 0,05% czerwieni fenolowej. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a następnie przystąpić do napełniania mikropipety, gdy próbka będzie gotowa do wstrzyknięcia.

Na początek należy wykonać mikropipety, które zostaną wykorzystane do iniekcji. Odbywa się to poprzez podgrzewanie i wyciąganie szklanych kapilar krzemianowych BOS w urządzeniu do wyciągania mikropipet. Po wyciągnięciu igieł są one przechowywane w szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny lub taśmy klejącej.

Następnie przygotujemy płytki z komorami do mikroiniekcji, wlewając 1,5% agarozy do trzech płytek z medium XE, posiadających formowane wgłębienia w kształcie klina. Posłuży to jako prosta metoda unieruchomienia embrionów podczas iniekcji. Płytki z komorami agarozowymi pozostawia się do stężenia, a następnie przechowuje w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

Aby rozpocząć napełnianie mikropipety, odetnij jej dystalną końcówkę za pomocą pęsety lub chirurgicznego ostrza, tworząc otwór ledwo widoczny pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 50 x. Następnie nanieś dwa mikrolitry roztworu roboczego.

Kładząc kroplę na szkiełku nakrywkowe, przymocuj tylną część mikropipety do strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w rurkę zakończoną igłą hipodermiczną, a następnie lekko zanurz końcówkę dystalną mikropipety w kropli roztworu roboczego. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety. Odessać roztwór roboczy przez koniec dystalny mikropipety, pociągając tłok strzykawki.

W następnym kroku skalibrujemy objętość iniekcji mikropipety. Nanieś kroplę oleju mineralnego na szkiełko mikrometryczne, a następnie włącz zasilanie oraz dopływ powietrza do aparatu mikroinjektora impulsowego. Następnie zamocuj mikropipetę w uchwycie mikropipety w aparacie mikroinjektora.

Mikroinżektor jest regulowany ciśnieniowo, a dozowanie jest aktywowane poprzez naciśnięcie pedału nożnego pod mikroskopem sekcyjnym. Sprawdź objętość wstrzykiwania, używając mikroinżektora do naniesienia kropli roztworu roboczego na olej mikrometryczny. Zmierz średnicę kropli, która unosi się w formie sfery na powierzchni oleju.

Dostosuj czas trwania i ciśnienie wtrysku, aby precyzyjnie skalibrować objętość iniekcji. Krok ten sprzyja powtarzalności eksperymentu z mikrowtryskami. W niniejszej prezentacji wszystkie mikrowtryski zostaną wykonane przy średnicy kropli wynoszącej 0.15 millimeters.

Na koniec, po skalibrowaniu objętości iniekcji, należy użyć pokrętła blokującego w mikroinjektorze, aby zapobiec cofaniu się cieczy oraz wyciekom z mikropipety. Teraz nadszedł czas na przygotowanie embrionów zebrafish. Ryby zebrafish kopulują w sposób losowy; w ciągu pierwszych kilku godzin każdego ranka, rozpoczynając przygotowania, należy zebrać embriony w stadium jednej komórki i umieścić je w pożywce XE 3.

Za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml rozmieść zarodki wzdłuż klinowatych rynien w płytkach komory do mikroiniekcji. Usuń nadmiar medium w taki sposób, aby zarodki były lekko zanurzone, a nie całkowicie zalane. Krok ten ułatwia osiadanie zarodków na dnie rynien oraz penetrację chorionu przez mikropipetę.

Przejdziemy teraz do iniekcji. Najpierw za pomocą mikropipety ustawimy zarodki tak, aby cytoplazma zarodka w stadium jednej komórki była widoczna pod mikroskopem stereoskopowym. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety; należy przebić chorion, a następnie żółtko, aby wprowadzić iniekcję do zarodka.

W niniejszym pokazie najpierw wykonamy mikroiniekcję do żółtka bezpośrednio poniżej komórki, umożliwiając dopływ roztworu roboczego do wnętrza komórki poprzez cytoplazmat i dyfuzję. Przepływ ten jest widoczny dzięki dodatkowi czerwieni fenolowej do roztworu roboczego. Ponieważ jest to embrion jednokomórkowy, iniekcję można przeprowadzić ręcznie lub za pomocą manipulatora.

Przeprowadzimy również demonstrację bezpośredniego wstrzyknięcia do cytoplazmy komórki. Bezpośrednia mikroiniekcja do komórki jest bardziej niezawodna, lecz czasochłonna, ponieważ wymaga odpowiedniej orientacji zarodka oraz precyzyjnej techniki mikroiniekcji. Ponieważ błona komórkowa jest bardziej odporna niż błona żółtka, często szybciej jest wprowadzić mikropipetę przez żółtko, aby dotrzeć do komórki.

Orientacja cytoplazmy tak, aby biegun zwierzęcy był skierowany ku dołowi rynienki, oraz pewność rąk mogą pomóc w tej metodzie iniekcji. Po mikroiniekcji umieść embriony w szalce Petriego z pożywką E3 i inkubuj je w temperaturze 28,5 °C w celu zapewnienia prawidłowego rozwoju. Przez następne kilka godzin i dni rozwoju embrionów obserwuj je pod kątem interesujących Cię fenotypów.

Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, będziemy monitorować ekspresję GFP w rozwijających się embrionach, zaczynając od stadium tarczy, za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całego embrionu in vivo. Ekspresja konstruktu jest najsilniejsza podczas wczesnych etapów rozwoju embrionalnego i często słabnie w miarę rozwoju, ponieważ wstrzyknięty RNA z czapką jest stopniowo degradowany, a efekt zależy od stabilności ekspresowanego białka. W oparciu o wcześniej opublikowane wyniki spodziewamy się, że morfologiczna budowa PKD2 będzie naśladować wygięcie grzbietowej osi ciała, jakie występuje u zmutowanych danio pręgowanych PKD2, oraz że torbiele nerkowe pojawią się około dwóch do trzech dni po zapłodnieniu.

Przedstawiliśmy właśnie niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą oligonukleotydów morpholino u rybek danio-pręgowanych; pamiętajcie, że podczas wykonywania tej procedury kluczowe jest zachowanie pewnej i stabilnej ręki podczas iniekcji. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.