Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie morfoligonukleotydów eno poprzez wstrzyknięcia komorowe do genów larwy, płetwy dorszowej i knock down w celu oceny ich funkcji podczas regeneracji. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie larwy i umieszczenie jej w rowku formy aros. Następnie igła do wstrzykiwań jest wprowadzana do komory serca.

Następnie roztwór morpho jest wstrzykiwany cztery do sześciu razy do komory z przerwami ważenia między impulsami, aby umożliwić oczyszczenie serca. Na koniec płetwa rozpieszczana jest amputowana i pozostawiona do regeneracji przez trzy dni. Ostatecznie wpływ na regenerację płetwy można następnie ocenić, mierząc zregenerowany obszar płetwy za pomocą narzędzia do śledzenia linii w oprogramowaniu open source Fiji image J.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transgeneza czy mutageneza, jest to, że umożliwia ona eliminację genów przez minos w tkankach larwalnych, które nie nadają się do bezpośrednich wstrzyknięć Używając szklanych naczyń włosowatych o średnicy 0,75 milimetra, umieść jedną w ściągaczu igieł i pociągnij igłę o następujących parametrach za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej, i pod stereoskopem z okularem mikrometrycznym rozbić naciągniętą kapilarę, aby uzyskać igłę o średnicy 20 mikrometrów. Następnie użyj tokarki z gumowym kołowrotkiem, aby naostrzyć igłę i uzyskać skos o długości 20 mikrometrów. Przygotuj wywar morpho, rozpuszczając liofilizowany morpho w jednym XPBS do końcowego stężenia 7,5 milimola.

Wymieszać roztwór do wstrzykiwań Morpho, łącząc 2,5 mikrolitra roztworu podstawowego Morpho z 2,8 mikrolitra jednego milimolowego roztworu podstawowego endo Portera, aby uzyskać końcowe stężenie 3,5 milimolowego morfu i 0,5 milimolowego endodono-portera do przeprowadzenia wstrzyknięć. Użyj mikropipety z końcówką o pojemności 10 mikrolitrów, aby załadować igłę ze skośnego szkła pięcioma mikrolitrami roztworu morpho. Następnie włóż szklaną igłę do uchwytu igły mikromanipulatora podłączonego do pneumatycznej pompy pico.

Ustawić kąt wstrzyknięć na około 45 stopni, tak aby igła musiała być przesuwana tylko w jednym kierunku strugarki. Następnie ustaw wartości mikrowtryskiwacza w następujący sposób: ciśnienie trzymania 20 funtów na cal kwadratowy lub PSI, ciśnienie wyrzutowe 15 PSIA 100 milisekund zakresu bramkowania i wartość okresu 1.9, co odpowiada 10.9 milisekundy. Przygotuj 20 mililitrów stopionego 1,5% aros w jednym XPBS i wlej go do 10-centymetrowej szalki Petriego.

Następnie umieść rowkowaną formę wtryskową w ciepłym aros, aby uformować bruzdy w utwardzonym żelu w celu znieczulenia larw. Umieść je w 100 mililitrach wody akwariowej z 20 miligramami na litr trikanu. Po tym, jak przestaną reagować na dotyk, użyj plastikowej pipety pasterskiej, aby ostrożnie przenieść larwę do rowka mokrej formy aros, tak aby strona brzuszna była skierowana w stronę pionowej ściany aros rowka.

Umieścić płytkę aros pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby komora była skierowana w stronę przeciwną do igły do wstrzykiwań. Następnie opuść igłę i włóż ją na około jeden do dwóch mikrometrów do komory serca. Uważając, aby nie wkładać go zbyt głęboko.

Następnie wstrzyknąć trzynanolitrowy impuls roztworu Morpho do komory i wagi, aby umożliwić oczyszczenie serca, przed powtórzeniem z pięcioma kolejnymi impulsami po wstrzyknięciu, usunąć igłę i umieścić ją na szalce Petriego zawierającej jeden XPBS, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie, za pomocą pipety transferowej wypełnionej pożywką E 3, ostrożnie przenieś larwy z powrotem na szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę E 3, aby zapewnić wychwyt i utrzymanie morfo w komórkach. Powtarzaj wstrzyknięcia co 12 do 24 godzin przez cały czas trwania eksperymentu, aby ocenić wstrzyknięcia.

Po znieczuleniu ryb umieść je na płaskiej mokrej płytce aros pokrytej pożywką E 3 przed użyciem mikroskopu stereoskopowego z jasnym polem i fluorescencją do ich zobrazowania. Analizuj obrazy pod kątem regeneracji za pomocą bezpłatnego oprogramowania Fiji Image J, aby użyć narzędzia do śledzenia linii w celu określenia ilości wzrostu regeneracyjnego, który nastąpił. Najpierw skalibruj obrazy, przeciągając i upuszczając plik do głównego okna Fiji w menu głównym.

Ustaw skalę dla wszystkich obrazów, klikając Analizuj w menu rozwijanym. Kliknij w ustaw skalę, a następnie włącz opcję globalną, klikając pole wyboru. Teraz ponownie przeciągnij i upuść obraz, aby zmierzyć stopień wzrostu regeneracyjnego na pasku narzędzi.

Wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego i określ obszar, który ma być mierzony. Na koniec naciśnij Ctrl M.Spowoduje to otwarcie nowego okna wyników pokazującego wartość zakreślonego obszaru w kwadratowych pikselach. Jak widać tutaj, w ciągu kilku minut od wstrzyknięcia, roztwór morpho endo porter rozprowadza się w całym układzie krwionośnym do różnych tkanek, takich jak fałd płetwy i mózg przez co najmniej 12 lub więcej godzin.

Aby ocenić regenerację dystalnych struktur płetwy larwalnej, usunięto następujące elementy: dystalny koniec fałdu płetwowego i rdzenia kręgowego, dystalny brak rdzenia, dystalny mięsień tułowia, który nie jest tutaj widoczny, oraz komórki barwnikowe, które są trudne do namierzenia przez bezpośrednie wstrzyknięcie, ale wydają się zawierać morfo po seryjnych iniekcjach komorowych. W ten sposób metoda ta stosunkowo łatwo sprzyja dostarczaniu morfo do tkanek, które są trudne do indywidualnego celu, i pozwala na ocenę funkcji genów w kilku tkankach w regenerującej się płetwie jednocześnie. Aby przeanalizować znaczenie określonych genów zaangażowanych w regenerację, larwalna płetwa dorszowa jest częściowo amputowana, a wszystkie tkanki, które włączyły morfo, są repreparowane.

Fałd płetwy larwalnej regeneruje swoją strukturę w ciągu kilku dni po amputacji, jak wykazano. W tym przypadku morpho celuje w geny niezbędne do regeneracji, zaburzone odpowiedź regeneracyjną w porównaniu do kontroli kontroli morfo po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją do zbadania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w regenerację płetwy danio pręgowanego.