Przetwarzanie macierzy cDNA PtGen2 sosny łobasowej

Niniejszy materiał wideo został przygotowany przez badaczy z Warnell School of Forestry and Natural Resources na Uniwersytecie Georgii. Celem tego filmu szkoleniowego jest szczegółowe omówienie sposobu przetwarzania naszych macierzy cDNA drugiej generacji LOB lolly pine pt, ze szczególnym uwzględnieniem płukania i obchodzenia się z macierzą, zarówno przed, jak i po hybrydyzacji. Co do zasady, nasze protokoły opierają się na metodach opracowanych w Institute for Genomic Research (TIGR) oraz Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility (VMSR), gdzie drukowane są nasze macierze.

Stwierdziliśmy, że w przypadku PT Gen two wymagana jest bardziej rygorystyczna obróbka, aby zapewnić najwyższy stopień spójności w zakresie jednorodności jakości sygnału i niskiego tła. Pierwszym krokiem jest wstępne przemywanie. Przeprowadzamy ten etap, ponieważ nasz bufor do nanoszenia kropek zawiera bardzo wysoką zawartość soli, a wstępne przemywanie jest niezbędne do jej usunięcia.

Preparaty umieszcza się w kasecie do szkiełek przedmiotowych i energicznie zanurza od 15 do 20 razy w 0,2% roztworze SDS, który został uprzednio podgrzany do 43°C. Po przemyciu szkiełek w roztworze SDS, zostają one ostrożnie przeniesione pęsetą do naczynia Copelanda zawierającego bufor do prehybrydyzacji. Bufor ten zawiera 5X SSC, 0,1% SDS oraz 1% BSA i jest również podgrzany do 43°C.

Słoik Copelanda pokrywa się parfum i umieszcza w inkubatorze w temperaturze 43°C na jedną godzinę. Po wstępnej hybrydyzacji preparaty przenosi się do kasety na szkiełka przedmiotowe i płucze sukcesywnie w pięciu zmianach wody dejonizowanej, zanurzając je od 15 do 20 razy w każdej zmianie. Na koniec preparaty umieszcza się w izopropanolu i zanurza pięć lub sześć razy, a następnie wirowuje do suchości w wirówce chip M mate.

Po wirowaniu slajdy są przedmuchiwane sprężonym powietrzem przepuszczonym przez filtr o wielkości 0,2 mikrona. Następnie na slajdy nakłada się szkiełka przykrywki, które również zostały oczyszczone sprężonym powietrzem, a za pomocą końcówki małej pipety ustawia się szkiełko przykrywki w odpowiedniej pozycji na slajdzie.

Po umieszczeniu pasków dystansujących, ale przed dodaniem buforu do hybrydyzacji, dodajemy 20 µL 100 mM dihi, trzy atol do otworów nawilżających znajdujących się na końcach komory. Teraz jesteśmy gotowi do dodania docelowych cDNA, które zostały resuspendowane w buforze do hybrydyzacji. Końcówkę pipety umieszcza się na krawędzi paska dystansującego oraz płytki, a następnie powoli nanosi roztwór.

Stwierdziliśmy, że wykorzystanie efektu kapilarnego do napełniania matryc zapewnia największą powtarzalność i znacznie ogranicza powstawanie niepożądanych pęcherzyków powietrza. Po dodaniu materiału docelowego do matrycy, komorę hybrydyzacyjną składa się i przykrywa folią aluminiową. Następnie komorę hybrydyzacyjną umieszcza się w wstrząsającej łaźni wodnej w celu inkubacji nocnej, zazwyczaj przez 14 do 16 godzin.

Kąpiel wodną ustawiono na 48 °C, a wytrząsarkę na 50 rpm. Należy również zauważyć, że od momentu dodania roztworu do hybrydyzacji, aż po wszystkie etapy przemywania po hybrydyzacji, procedury są przeprowadzane przy słabym oświetleniu, aby zapobiec fotoutlenianiu. Następnego dnia preparaty są wyjmowane z komory do hybrydyzacji i umieszczane w słoiku Copelanda zawierającym pierwszy roztwór do przemywania, który został uprzednio podgrzany do 53 °C.

Przełazki pozostawia się w naczyniu Copelanda przez około minutę, aż do momentu oddzielenia się pasków podtrzymujących, po czym ostrożnie wyjmuje się je pęsetą i umieszcza w kasecie do szkiełek przedmiotowych, aby przystąpić do płukania. Następnie przełazki zanurza się energicznie około 15 do 20 razy w drugim naczyniu, również zawierającym roztwór płuczący numer jeden w temperaturze 53 stopni. Naczynie przykrywa się parafilitą i umieszcza w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 53 stopnie i 100 RPM.

Po 10-minutowej inkubacji i zastosowaniu roztworu płuczącego nr 1, preparaty na szkiełkach są energicznie zanurzane 15–20 razy w pojemniku z roztworem płuczącym nr 2, który znajduje się w temperaturze pokojowej. Pojemnik ten zostaje przykryty folią Parafilm i ponownie umieszczony na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 10-minutową inkubację. Na koniec szkiełka są wyjmowane z roztworu płuczącego nr 2 i energicznie zanurzane 15–20 razy w pojemniku z roztworem płuczącym nr 3.

Następnie slajdy przenosi się do drugiego pojemnika z roztworem piorącym numer trzy przykrytego Parafilmem i ponownie umieszcza się na wytrząsarce na 10 minut. Po końcowym płukaniu odwirujemy slajdy do całkowitego osuszenia. W tym celu wkładamy nakrętkę od probówki Falcon 15 ml do probówki stożkowej 50 ml, a następnie umieszczamy matryce w probówce stożkowej stroną z kodem kreskowym do dołu.

Następnie probówki wiruje się w rotorze z koszyczkami przy 1500 RPM w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu preparaty przenosi się do drugiego zestawu probówek stożkowych o pojemności 50 ml, które zostały owinięte folią aluminiową. Następnie probówki przepłukuje się azotem, który został przefiltrowany przez filtr 0,22 micron, a następnie zamyka je do transportu lub przechowywania do czasu skanowania.

Dane z elektronicznego skanowania zbieramy przy użyciu skanera PerkinElmer scan array 5, 000. Obraz macierzy zostaje podzielony na siatkę, a surowe dane skanowania są przetwarzane i poddawane wstępnej analizie za pomocą pakietu oprogramowania obrazowego firmy Bio Discovery. Następnie dane dotyczące intensywności sygnału w punktach są normalizowane, a analizy statystyczne są wykonywane przy użyciu BRB array tools — wszechstronnego i bezpłatnie dostępnego pakietu statystycznego do analizy mikromacierzy, który można pobrać z Narodowego Instytutu Nowotworów (National Cancer Institute).

Pozostałe analizy statystyczne oraz poszukiwania wzorców ekspresji genów są przeprowadzane za pomocą zestawu narzędzi do analizy i poszukiwania wzorców ekspresji genów Jeep PPAs, który jest kolejnym ogólnodostępnym pakietem analitycznym opartym na przeglądarce internetowej. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu dotyczącego sposobu przetwarzania danych z mikromacierzy loblolly pine PT Gen two.

Za treść i produkcję tego filmu szkoleniowego odpowiadały następujące osoby.