Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Aby zmapować miejsca wiązania rybonukleoprotein na pre-mRNA, należy rozpocząć od pokrycia wyznaczonego regionu interesującego pre-mRNA oknami o szerokości 30 nukleotydów i zsyntetyzować te kafelkowane oligonukleotydy na matrycy. Oligonukleotydy są uwalniane z matrycy poprzez gotowanie, a następnie współstrącane z interesującą RNP. Całkowita pula początkowa jest znakowana SCI 3, a pula związana jest znakowana SCI 5, po czym obie są naniesione na matrycę detekcyjną.

Następnie macierz jest skanowana, a oprogramowanie do ekstrakcji cech służy do interpretacji wyników. Sole. Cześć, jestem Kate Watkins z laboratorium Willa Fairbrothera w Departamencie MCB na Uniwersytecie Brown. Dzisiaj zaprezentuję szybką i niedrogą procedurę określania dokładnej lokalizacji kompleksu białko-RNA na prem RNA w laboratorium, syntetyzując prem A jako pulę nakładających się oligonukleotydów.

Pulę tę można następnie podzielić na frakcję związaną i niezwiązaną za pomocą koimmunoprecypitacji, a następnie poddać analizie za pomocą mikromacierzy. Choć procedura ta ma wiele zastosowań, wykorzystujemy ją do badania wielu czynników splicingowych oraz ich roli w alternatywnym splicingu. Zatem zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy skorzystać z przeglądarki genomu uc SC w celu pobrania konkretnych genów, złączy splicingowych lub innych obszarów zainteresowania, na podstawie których zostanie zaprojektowana pula prem A. Wybierz interesujące okna, a następnie przeprowadź ich komputerowe kafelkowanie z długością odczytu 30 nukleotydów i nakładką 20 nukleotydów, tak aby każdy oligonukleotyd był przesunięty o 10 nukleotydów względem poprzedniego. Po zdefiniowaniu oligonukleotydów o długości 30 nukleotydów, należy flankować każdy z nich uniwersalnymi sekwencjami starterów.

Przekaż oligonukleotydy do firmy Agilent w celu ich naniesienia na niestandardową macierz oligonukleotydową. Po otrzymaniu macierzy rozpocznij odzyskiwanie oligonukleotydów DNA z jej powierzchni, umieszczając szkiełko przykrywcze macierzy w komorze do hybrydyzacji macierzy i delikatnie n nanosząc pipetą 500 µL wody dejonizowanej na szkiełko. Połóż szkiełko z macierzą stroną roboczą do dołu na szkiełku przykrywczym w taki sposób, aby etykiety na obu szkiełkach były skierowane ku sobie, dbając o to, by nie powstały pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić proces odzyskiwania oligonukleotydów.

Zamknąć komorę hybrydyzacyjną i inkubować ją przez noc w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 99 °C, obracając komorę. Następnego dnia ostrożnie wyjąć macierz z komory i odessać wodę, która zawiera teraz oligosy uwolnione z powierzchni macierzy. Przenieść pulę uwolnionych oligosów do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i poddać sonikacji w celu rozbicia potencjalnych agregatów, stosując amplitudę 50% podczas trzech serii impulsów trwających od trzech do pięciu sekund każda. Następnie przeprowadzić amplifikację puli za pomocą PCR o niskiej liczbie cykli, wykorzystując primery uniwersalne z przyłączonym do końca promotorem T.

Liczba wymaganych cykli może się różnić w zależności od wydajności odzyskiwania oligonukleotydów. Należy unikać nadmiernej amplifikacji, która objawia się jako rozmyta prążek na żelu akrylamidowym. Na koniec należy użyć zestawu mega short script z firmy Amon do transkrypcji RNA.

Reakcję transkrypcji należy przerwać poprzez ekstrakcję RNA fenolem i chloroformem, a następnie przeprowadzić precypitację etanolem z użyciem octanu sodu oraz glyco blue jako nośnika. Osad RNA należy ponownie zawiesić w 105 µL buforu TE, aby dokładnie określić stężenie RNA.

Użyj barwnika ribo green do przygotowania krzywej wzorcowej. Następnie wykonaj pomiar za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek. Pula RNA jest teraz gotowa do rozpoczęcia procesu wyciągania (pull down) w ramach koimmunoprecypitacji.

W pierwszej kolejności należy przygotować kuleczki magnetyczne, łącząc kuleczki dyna białka A i białka G w stosunku jeden do jednego do końcowej objętości 50 µL na jedną reakcję. Kuleczki należy skoncentrować w jednym miejscu za pomocą statywu do separacji magnetycznej w celu usunięcia nadsączu. Następnie należy przeprowadzić dwa przemycia równą objętością zimnego 1x PBS; drugie przemycie jest etapem końcowym.

Resuspenduj kulki w równym objętości zimnego 1x PBS i dodaj 2 ng przeciwciała perion. Ilość ta może się różnić w zależności od przeciwciała, dlatego może być konieczne przeprowadzenie eksperymentów w celu znalezienia optymalnych warunków wiązania przeciwciała z kulkami. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C na platformie rotacyjnej.

Rano, aby zablokować niespecyficzne wiązanie, dodaj do każdej reakcji 2 µg sonikowanego całkowitego RNA drożdży i inkubuj w rotacji przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu etapu blokowania ponownie użyj statywu magnetycznego, aby usunąć nadsącz. Następnie przemyj kulek dwukrotnie zimnym 1x PBS; po drugim przemyciu pozostaw PBS w probówce, a następnie odmień 50 µl zawiesiny kulek do nowych probówek.

Jedna probówka dla każdej reakcji ko-immunoprecypitacji (co IP). Kuleczki są teraz gotowe do co IP. Następnie należy przygotować mieszaninę główną (master mix), łącząc pulę oligonukleotydów RNA z ekstraktem jądrowym komórek.

Jako źródło RNP pobierz 50 µL aliquoty master mixu jako próbę całkowitą. W celu ochrony można dodać Primery, które są wersjami RNA starterów uniwersalnych, aby zapobiec wiązaniu białek do sekwencji startera lub wprowadzeniu struktur drugorzędowych do RNA. Aby rozpocząć ko-immunoprecypitację, oddziel supernatant od aliquotów kulek i resuspenduj kulki w 120 µL pozostałego master mixu. Inkubuj reakcje w wytrząsalniku w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch godzin.

Po zakończeniu inkubacji z każdej probówki można usunąć niewielką ilość eluatu, wliczając w to kuleczki. W celu przeprowadzenia dodatkowych testów wydajności lub specyficzności wiązania, umieść pozostałe reakcje na magnesie i usuń nadsącz. Następnie wykonaj jeden lub dwa przemycia zimnym 1x PBS.

RNA związane z przeciwciałem na koralikach poprzez kompleks RNP stanowi próbkę IP. Zawiesić ponownie koraliki IP w 50 µl 1% SDS w buforze 0,1 XTE i podgrzać próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Aby wyeluować RNA, usunąć supernatant, który zawiera teraz RNA uprzednio związane z koralikami; oczyścić go poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie przeprowadzić wytrącanie etanolem i zawiesić ponownie osad w 50 µl buforu 0,1 XT.

Następnie przeprowadź odwrotną transkrypcję próbek z użyciem uniwersalnych starterów odwrotnych. Następnie przeprowadź amplifikację próbek metodą PCR przy użyciu starterów uniwersalnych, jeden z których powinien zawierać promotor T7. Liczba cykli wymaganych do amplifikacji puli będzie zależeć od wydajności współimmunoprecypitacji.

Używając zestawu do skryptu mega shorts firmy Ambion, przeprowadź ponowną transkrypcję próbek, ale tym razem dodaj 2 µL amino-allylowego UTP zamiast T7 UTP dołączonego do zestawu. Amino-allylowe UTP zostanie wykorzystane w późniejszym etapie do znakowania RNA za pomocą side eyes. Po zakończeniu transkrypcji.

Ekstrakt fenylchloroformowy i etanol powodują wytrącenie próbek. Nie należy używać gliko-niebieskiego ani octanu amonu, ponieważ mogą one zakłócać hybrydyzację próbek z macierzą. Osad należy ponownie zawiesić w 4,5 µL 0,1 M węglanu sodu.

Aby najpierw oznakować próbki, dodaj 2,5 µL wody wolnej od nukleaz do całkowitej objętości próbki. Dodaj 3 µL S3, a do próbki IP dodaj 3 µL SCI pięć. Inkubuj w ciemności przez jedną godzinę.

W temperaturze pokojowej przerwać reakcję, dodając sześć µL 4 M HCl hydroksyloaminy do każdej próbki, dokładnie wymieszać i odwirować. Inkubować krótko przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oczyścić znakowane próbki poprzez ekstrakcję chloroformem fenolowym, a następnie wytrącenie etanolem. Większość barwnika zostaje przeniesiona do fazy organicznej wraz z wolnymi nukleotydami, dlatego osady mogą nie być widocznie zabarwione.

Resuspender każdy pellet w 50 µL 0,1 XTE. Postępować zgodnie z instrukcją zestawu do hybrydyzacji macierzy Agilent w celu przygotowania próbki do mikroarray, z następującym wyjątkiem: nie fragmentować RNA. Po dodaniu buforu do fragmentacji należy niezwłocznie dodać bufor do hybrydyzacji, aby przerwać proces fragmentacji.

Nanieś próbki na matrycę i przeprowadzaj hybrydyzację w temperaturze 50 °C przez trzy godziny podczas obracania matrycy. Przygotuj następujące roztwory o objętości 50 ml w stożkowatych probówkach o pojemności 50 ml: jedną probówkę z dwukrotnym nadmiarem buforu SC, dwie probówki z jednokrotnym nadmiarem buforu SC oraz jedną probówkę z wodą zdejonizowaną.

Po trzechgodzinnej inkubacji ostrożnie rozepnij zaciski kanapki z preparatem na szkiełku i umieść go w buforze 2X SSC. Używając pęsety, delikatnie oddziel matrycę od szkiełka nakrywki.

Ostrożnie zdejmij szkiełko zakrywające, uważając, aby nie dotknąć matrycy. Po wyjęciu szkiełka zamknij probówkę stożkową i delikatnie odwracaj ją przez 60 sekund. Za pomocą pęsety przenieś matrycę do roztworu 1X SSC.

Zamknąć probówkę i delikatnie odwracać przez jedną minutę. Następnie przenieść matrycę do drugiego roztworu XSSC i ponownie delikatnie odwracać przez kolejną minutę. Na koniec przenieść matrycę do probówki z wodą dejonizowaną i delikatnie odwracać przez 30 sekund.

Osusz macierz, opierając krawędzie szkiełka o chusteczkę Kimwipe. Kontynuuj obracanie macierzy na chusteczce, uważając, aby nie uszkodzić strony zawierającej oligos. Umieść macierz w pustej probówce stożkowej i przystąp do skanowania macierzy.

Następnie przystąp do skanowania macierzy. Oto reprezentatywna macierza. Każda cecha lub oligo jest zabarwiona na kolor zielony w przypadku całkowitej, niewzbogaconej puli lub na czerwony w przypadku puli wzbogaconej metodą IP.

Sygnał dla każdej cechy jest normalizowany do całkowitej intensywności w danym kanale. Wynikiem końcowym jest logarytmiczny stosunek intensywności kanału czerwonego do kanału zielonego. Dla każdej cechy na matrycy średnia wartość dla każdej współrzędnej genomowej jest przypisana do określonej lokalizacji.

Ilustracja tego etapu uśredniania została przedstawiona dla trzech nakładających się oligonukleotydów o długości 30 nukleotydów z wynikami wynoszącymi odpowiednio dwa, cztery i 0,5, gdzie pokazano średni wynik wzbogacenia dla każdego okna o długości 10 nukleotydów. Oto przykład schematu wiązania białka wiążącego polipirymidyny PTB w genie CLTA; cechy genu są podane na dole, a logarytmiczne średnie wyniki wzbogacenia dla wiązań PTP są reprezentowane przez ciemnoczerwone pionowe paski. Jasnoczerwone paski wskazują obszary niewzbogacone pod kątem wiązania PTP.

Właśnie zaprezentowałem, jak szybko i efektywnie stworzyć pulę oligonukleotydów pokrywającą regiony zainteresowania, takie jak alternatywnie splicingowane aksony. Analizujemy nasze pule za pomocą mikromacierzy, ale możliwe jest również ich sekwencjonowanie metodą Illumina, sekwencjonowaniem Lexi lub tradycyjnym sekwencjonowaniem metodą Sangera. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie, że proces tworzenia puli może być modyfikowany zarówno na poziomie RNA, jak i białek.

Na poziomie RNA do sekwencji oligonukleotydowej możemy wprowadzić regiony autologiczne, mutacje chorobowe, polimorfizmy lub mutacje losowe. Na poziomie białka czynnik wiążący RNA może zostać zmodyfikowany poprzez fosforylację lub inne modyfikacje potranslacyjne. Można również manipulować środowiskiem wiązania, aby zwiększyć lub zmniejszyć poziom dodatkowych czynników, które konkurują z badanym białkiem wiążącym RNA lub wchodzą z nim w interakcje.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.