Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Procedura ta rozpoczyna się od hodowli szczepu przynęty w pożywkach zawierających normalne aminokwasy w przypadku szczepu kontrolnego SLAC oraz ciężko izotopową lizynę i argininę. Równe ilości obu szczepów są mieszane i lizowane poprzez rozcieranie w ciekłym azocie. Surowe lizaty są najpierw pelletowane za pomocą wirówki, a następnie oczyszczane poprzez wiązanie do kulek spheros. Lizat komórkowy jest następnie wiązany do kulek IgG.

Białka związane z kuleczkami IgG są trawione proteazą, uwalniane poprzez cięcie i wytrącane. Próbka jest teraz gotowa do analizy metodą spektrometrii mas. Cześć, nazywam się Jesse Chao i reprezentuję laboratorium Lone w Katedrze Biologii Środowiska Komórkowego w Instytucie Nauk o Życiu na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej.

W dzisiejszym materiale zaprezentujemy procedurę ilościowej analizy proteomicznej zwaną SILAC, połączoną z oczyszczaniem powinowactwem. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kompleksów białkowych.

Zacznijmy. W tej procedurze szczep przynęty zawiera normalne aminokwasy, natomiast szczep kontrolny SLAC zawiera ciężkie izotopy lizyny i argininy. Aby rozpocząć, należy najpierw oddzielnie wyhodować po jednym litrze szczepu przynęty i szczepu kontrolnego do wartości wyświetlonej na ekranie. Następnie przelej kultury do 500 mililitrowych probówek wirówkowych Nalgene.

Zrównoważyć obciążenie i wirować zawiesiny komórkowe przy 2580 RCF, odlać medium i resuspender osad w 50 mililitrach zimnej D H2O, przenosząc komórki do probówek do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Wirować probówki w celu osadzenia komórek przy 3000 RCF. Na tym etapie można zamrozić osad w temperaturze -80 °C.

Ważne jest, aby dopasować kulturę szczepu kontrolnego do kultury szczepu przynęty w stosunku jeden do jednego według suchej masy osadu. Resuspendować każdy osad komórkowy w 10 mililitrach buforu NP 40 z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteaz w stosunku jeden do 2000. Wymieszać obie kultury komórkowe, przelewając bezpośrednio zawartość jednej probówki do drugiej.

Aby rozpocząć rozcieranie komórek, najpierw wlej ciekły azot do schłodzonego wcześniej moździerza i poczekaj, aż całkowicie odparuje. Następnie dodaj do moździerza 2 ml komórek. Dolej niewielką ilość ciekłego azotu, aby zamrozić komórki.

Ucierać komórki, aż powstanie drobny proszek. Powtórzyć ten proces, aż wszystkie komórki zostaną utarte. Należy dopilnować, aby komórki nie odtajały.

W razie potrzeby dodać ciekły azot. Następnie przenieść proszek do zlewka schłodzonego w lodzie i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Gdy krawędzie zaczną tajać, dodać 20 ml buforu NP 40 z PIC w stosunku 1:200 po całkowitym rozmrożeniu.

Przenieś surowy lizat do probówek Nalgene o pojemności 40 ml i wiruj przy 16 000 RPM w rotorze Sovos SA 600 przez 30 minut. W czasie oczekiwania pobierz 300 µl kulek SROs two B i przemyj je trzykrotnie w 300 µl buforu NP 40. Następnie resuspenduj kulki w 300 µl buforu, aby uzyskać zawiesinę w stosunku jeden do jednego.

Kolejnym krokiem jest wstępne oczyszczenie lizatu komórkowego. W tym celu należy najpierw przenieść nadsącz do nowej probówki i dodać koraliki Spheros two B. Inkubować na platformie rotacyjnej w pomieszczeniu chłodniczym przez 30 minut.

Podczas inkubacji pobierz 300 µL kulek IgG SROs six i przemyj je trzykrotnie w 300 µL buforu NP 40. Następnie resuspenduj kulki w 300 µL buforu, aby uzyskać zawiesinę w stosunku jeden do jednego. Po inkubacji odwiruj SROs w celu uzyskania osadu.

Włożyć dwa koraliki. Przenieść nadsącz do nowej probówki. Pamiętać o zachowaniu alikwotu lizatu komórkowego do późniejszego rozdzielczego western-blottingu.

Następnie należy dodać kuleczki IgG. W celu zwiększenia wydajności wiązania należy rozdzielić zawartość do dwóch probówek i inkubować na rotatorze w pomieszczeniu chłodniczym przez dwie godziny. Po inkubacji kuleczki należy zebrać w kolumnie chromatograficznej w temperaturze 4 °C.

Należy pamiętać o zachowaniu aalikwoty frakcji niezwiązanej. Przemyj kuleczki 10 ml buforu NP 40.

Następnie przemyj kuleczki trzema mililitrami buforu TEVC. Ponownie pamiętaj, aby zachować alikwot kuleczek.

Będzie to odzwierciedlać wydajność wiązania podczas elucji kulek. Najpierw należy dodać pięć µL A-C-T-E-V do jednego mL buforu TEVC. Dodać bufor TEVC do kulek i wymieszać.

Przenieś zawartość do dwóch probótek EINOR o pojemności 1,5 mililitra w celu zapewnienia bardziej efektywnego mieszania i inkubuj na platformie rotacyjnej w chłodni przez noc. Następnie odwirowuj koraliki i przenieś eluat do nowej probótki o pojemności 1,5 mililitra. Przemyj koraliki dodatkowymi 0,5 mililitrami buforu TEVC po zakończeniu płukania.

Połącz wszystkie osiem frakcji w jednej probówce. Łącznie powinno powstać 1,5 mililitra eluatu ELU 8. Odstaw alikwot eluatu TEV 8 w celu przeprowadzenia wytrącania.

Doprowadzić alikwoty do stężenia 25% TCA za pomocą stężonego roztworu TCA (100%). W tym celu podzielić 1,5 mililitra LU 8 do dwóch probówek, po 750 mikrolitrów do każdej. Do probówki dodać 250 mikrolitrów 100% TCA.

Roztwór powinien stać się mętny. Następnie należy go umieścić na lodzie na 30 minut, okresowo mieszając zawiesinę na wortexie po inkubacji.

Wiruj z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w pomieszczeniu chłodniczym przez 30 minut. Przemyj raz 500 µL lodowatego acetonu zawierającego 0,05 N kwasu solnego. Następnie wiruj przez pięć minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.

Następnie przemyj raz 500 µL lodowatego acetonu i wiruj przez pięć minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie usuń aceton i osusz osad w celu przeprowadzenia barwienia srebrem. Resuspenduj osad w 50 µL buforu do próbek SDS o stężeniu 1×.

Jeśli planują Państwo wykorzystać wytrącone białko do analizy opartej na spektrometrii mas, zaleca się wytrącanie przy użyciu etanolu. Aby to zrobić, należy najpierw dodać 20 µg glikogenu, następnie rozcieńczyć próbki pięciokrotnie stoprocentowym etanolem i dostosować stężenie do 50 mM wodorowęglanu sodu, używając roztworu treściwego 2,5 M o pH 5,0. Roztwór należy wymieszać poprzez odwracanie probówki.

Pozostawić na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec podzielić zawartość do dwóch probówek typu Eppendorf. Osad z wytrąconego białka zebrać poprzez wirowanie przez 10 minut przy 12 000 g w temperaturze pokojowej.

Alikwoty zachowane podczas procedury oczyszczania powinny obejmować lizat komórkowy po wstępnym oczyszczeniu, frakcję związaną, frakcję niezwiązaną oraz frakcję eluowaną. Zalecamy analizę zawartości białek w powyższych alikwotach za pomocą techniki Western blotting z użyciem przeciwciała anty-TAP lub barwienia srebrem, aby ocenić wydajność wiązania i elucji w eksperymencie. Na tym żelu barwionym srebrem zwizualizowano oczyszczone białko SCS two tap wraz z jego partnerami oddziaływań i porównano je z kontrolą nieoznakowaną w tym Western blot.

Różne frakcje pobrane podczas oczyszczania SCS two tap zostały poddane analizie metodą Western blottingu przy użyciu przeciwciała Antit tap. Zauważono, że SCS two tap migrował w kierunku niższej masy cząsteczkowej po elucji poprzez cięcie proteazą TEV, a po elucji na kuleczkach IgG nie pozostało żadnego SCS two tap. Potwierdziło to wysoką wydajność procesu oczyszczania.

Właśnie pokazaliśmy, jak oczyszczać kompleksy białkowe za pomocą oczyszczania powinowactwa z wykorzystaniem kulek IgG. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed rozpoczęciem procesu oczyszczania upewnić się, że szczep bazowy i szczep kontrolny są dopasowane pod względem masy suchego osadu. Ponieważ metoda LAC zapewnia nam bezstronne i ilościowe pomiary partnerów wiązania białek, przeprowadzamy jedynie pierwszy etap oczyszczania metodą tap, aby zminimalizować utratę próbki.

Jeśli wystąpi znaczna ilość niespecyficznego wiązania, można przeprowadzić cały protokół, który znajduje się w instrukcji cold springing harbor. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

Hej, no chodź, Mark. Ah, idź.