Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Celem niniejszego eksperymentu jest identyfikacja białek, oddziaływań białkowych oraz składu podjednostek natywnych kompleksów MultiPro z E. coli. Osiąga się to poprzez amplifikację specyficznych dla sekwencji liniowych produktów PCR, kodujących znacznik SPA oraz marker selekcyjny, które są integrowane i ekspresowane w ramce odczytu jako fuzje karboksyterminalne w szczepie ddy 3, 3 0 przy użyciu bakteryjnego systemu rekombinacji faga lambda; w drugim kroku przeprowadzana jest dwustopniowa puryfikacja z wykorzystaniem cow modlin i kulek powinowactwa Anti-Flag w celu efektywnego odzyskania niskobiełkowych kompleksów białkowych. Następnie białka związane, eluowane za pomocą cow modlin, buforu elucyjnego lub CEB, poddawane są trawieniu trypsyną i analizie metodą spektrometrii mas w celu identyfikacji białek.

Uzyskane wyniki pokazują, że kilka podjednostek rdzeniowego enzymu polimerazy RNA, w tym czynniki terminacji transkrypcji i antydeterminacji, zostało efektywnie kopuryfikowanych z oznakowaną białkiem podjednostki D polimerazy RNA, co wskazuje, że nowo powiązane komponenty mogą być skutecznie wykrywane przy użyciu tego podejścia. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z dwuetapową puryfikacją powinowactwa, w której staranne przetwarzanie lizatów komórkowych z odpowiednimi roztworami buforowymi jest absolutnie niezbędne, aby zapewnić sukces w efektywnym odzyskiwaniu kompleksów o niskiej i wysokiej zawartości z kultur wielkoskalowych. Procedury puryfikacji powinowactwa i spektrometrii mas zaprezentują Olga Kagan i HBO guo, dwaj technicy w moim laboratorium. Niniejszy protokół rozpoczyna się od celowania w specyficzne sekwencje amplifikowane w szczepie DDY three 30, w którym ekspresjonowany jest mechanizm rekombinacji Lambda red, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Następnie szczep bakterii wykazujący system rekombinacji faga Lambda inkubuje się przez noc w 2 ml pożywki Luria-Bertani lub LB w temperaturze 32 °C, przy wstrząsaniu z prędkością 180 RPM. Następnego dnia 1 ml kultury nocnej szczepia się do 70 ml świeżej pożywki LB w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml. Inokulum hoduje się w temperaturze 32 °C, wstrząsając z prędkością 180 RPM, aż OD 600 osiągnie wartość około 0,8. Indukcję komórek przeprowadza się poprzez inkubację kolby w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C, delikatnie wstrząsając z prędkością 180 RPM przez 15 minut.

Bezpośrednio po indukcji inkubować kolbę w kąpieli z mieszaniny lodu i wody przez co najmniej 30 minut przy potrząsaniu. Po zebraniu i wypłukaniu komórek zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, ponownie zawiesić osad komórkowy w 700 µL lodowatej, sterylnej wody, aby uzyskać komórki elektrokompetentne do elektroporacji. Wprowadzić 1 µL oczyszczonego amplikonu do 40 µL komórek elektrokompetentnych.

Komórki poddaje się elektroporacji po rekombinacji homologicznej i integracji. Transformanty, w których tag lub kaseta zostały pomyślnie włączone do chromosomu, są selekcjonowane na podstawie oporności na kanamycynę. Wybierany jest zestaw transformantów do analizy western blotting w celu weryfikacji prawidłowego wytworzenia białek fuzyjnych z tagiem SPA przy użyciu przeciwciała Anti-Flag M2, które jest specyficzne dla epitopów flag tagu SPA. Przenosi się 10 ml kultury nocnej do 990 ml świeżej pożywki TB, uzupełnionej o 25 µg/ml kanamycyny, w kolbie o pojemności 4 litrów.

Hodowlę inkubowano w temperaturze 32 °C przy stałym wstrząsaniu z prędkością 250 RPM przez pięć do sześciu godzin, aż OD 600 osiągnie wartość od dwóch do trzech. Jeden litr hodowli e coli SPA tag przeniesiono do czystych butelek do wirowania i odwirowano komórki w temperaturze 4 °C przy 3 993 ×g przez 15 minut. Następnie zawiesino komórki zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Przenieś próbki do sterylnego kubka ze stali nierdzewnej umieszczonego w lodzie w celu przeprowadzenia sonikacji. Zanurz sondę w próbce i sonikuj przez trzy minuty. Po sonikacji odczekaj dodatkowe dwie minuty, aby próbka ostygła po przegrzaniu, a następnie odwiruj lizat po sonikacji.

Ostrożnie przenieś supernatant S z probówki do wirowania do 50 mililitrowej polipropylenowej probówki typu Falcon. Zamroź próbkę w ciekłym azocie i przechowuj zamrożony, sonikowany ekstrakt komórkowy przez maksymalnie sześć miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Aby rozpocząć oczyszczanie powinowactwa zamrożonego, sonikowanego ekstraktu komórkowego, umieść probówkę w zimnej wodzie, a następnie inkubuj ekstrakt komórkowy TH z trzema mikrolitrami benzo, nukleazy, przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Do tak przygotowanej mieszaniny należy dodać niejonowy detergent Triton X 100 oraz 200 µL zawiesiny kulek agro beads z przeciwciałem Anti-Flag M2. Zawartość delikatnie wymieszać, rotując probówką przez trzy godziny w temperaturze 4 °C. Po trzech godzinach rotacji probówkę odwirować z prędkością 1 700 ×g przez sześć minut. Po centrifugacji ostrożnie usunąć jak największą ilość nadsądu, uważając, aby nie naruszyć luźnego osadu.

Resuspenduj osad w pozostałym roztworze SNA, a następnie przenieś go do polipropylenowej kolumny do preparatyki. Wyjmij dolne korki odpływowe kolumny, aby umożliwić spływanie eluatu siłą grawitacji. Następnie przemyj kolumnę pięciokrotnie 200 µL jednokrotnym buforem FC i przystąp do etapu cięcia TEV zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Po odszczepieniu szybko i szczelnie zamknij kolumnę zarówno od góry, jak i od dołu. Delikatnie wymieszaj zawartość kolumny poprzez rotację przez noc w temperaturze 4°C. Zlej eluat, zdejmując górną nasadkę i dolny korek, do nowej kolumny.

Przemyj starą kolumnę 400 µL 1x buforu wiążącego Cal Modlin oraz 150 µL zawiesiny kulek wiążących Cal Modlin. Eluuj związane białko w czterech frakcjach po 50 µL do nowej probówki eend orph, używając 1x buforu elucyjnego Cal Modlin.

Rozdziel eluat na dwie czyste probówki typu eend orph w równych objętościach. Następnie odparuj zawartość obu probówek za pomocą wirówki próżniowej. Wysuszony eluat z jednej probówki służy do przeprowadzenia elektroforezy z barwieniem srebrem, zgodnie z opisem w tekście, natomiast pozostały jest przechowywany w temperaturze -80 °C.

W celu późniejszego zastosowania w spektrometrii mas, do wysuszonej próbki należy dodać 50 µL buforu trawiennego oraz 0,9 µL 100 mM chlorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny; mieszaninę inkubuje się przez 45 minut w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia etapu redukcji. Następnie, aby umożliżlić alkilację próbki, dodaje się 1 µL 500 mM iodoacetamidu i inkubuje w ciemności przez kolejne 40 minut. Po drugiej serii inkubacji do mieszaniny dodaje się 1 µg trypsyny. Próbkę inkubuje się przez pięć godzin w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze pokojowej.

Należy pamiętać o zatrzymaniu reakcji poprzez dodanie jednego mikrolitra kwasu octowego. Następnie należy przygotować końcówkę Millipore zip tip zgodnie z opisem w tekście, aby zapewnić efektywne wiązanie peptydu z końcówką. Mieszaninę peptydową należy wymieszać 20 razy, a następnie wypłukać zmieszaną z końcówką próbkę poprzez aspirację i dyspensowanie roztworu płuczącego.

Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby zapewnić efektywne wiązanie mieszaniny peptydów z końcówką, używając końcówki z przywiązanym peptydem. Pobierz 10 µL roztworu zwilżającego i ekwilibrującego, a następnie przeniesienie go do czystej probówki typu Eppendorf. Powtórz ten krok dwukrotnie.

Po wysuszeniu eluatów w wirówce próżniowej (speed vacuum), próbki można poddać natychmiastowej analizie metodą spektrometrii mas lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Mikrokolumny zastosowane w tej procedurze są wypełnione warstwą około 10 cm żywicy Lunar C 18 o rozmiarze cząstek 3 µm i są połączone z nano-źródłem jonizacji przez rozpylanie elektrostatyczne Pro Zion, które znajduje się w linii z instrumentem Orbitrap. Do zapewnienia stabilnego przepływu z końcówki na poziomie około 300 nL/min podczas rozdzielania peptydów wykorzystywana jest binarna pompa HPLC Pro Zion nano flow; w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia peptydów należy ustawić gradient buforu organicznego zgodnie ze stopniem złożoności próbki.

W przypadku tej próbki SPA z E. coli, mobilna faza rozpuszczalnika A składa się z 95% wody gradientowej do HPLC i 5% acetonitrylu z 0,1% kwasu mrówkowego, natomiast rozpuszczalnik B zawiera 5% wody gradientowej do HPLC i 95% acetonitrylu z 0,1% kwasu mrówkowego. Po przeprowadzeniu spektrometrii mas należy przeszukać widma, wykorzystując algorytm wyszukiwania w bazie danych, taki jak SEQUEST, w odniesieniu do bazy sekwencji białek E. coli. Wyniki należy przefiltrować statystycznie za pomocą algorytmu probabilistycznego, takiego jak STARQUEST, aby zapewnić niski wskaźnik fałszywych odkryć. Zarówno znakowany w systemie SPA czynnik sigma polimerazy RNA, jak i białko YakL o nieznanej funkcji, współoczyszczały się specyficznie z enzymem rdzeniowym polimerazy RNA, w tym z podjednostkami alfa, beta i beta pierwsza, a także z czynnikiem recyklingowym polimerazy RNA. W przeciwieństwie do znakowanego czynnika sigma polimerazy RNA, YakL wiązał się dodatkowo z niezbędnym antyterminacyjnym czynnikiem terminacji transkrypcji, co sugeruje wyspecjalizowaną funkcję w transkrypcji.

Za pomocą LCMS wykryto również kilka innych mniejszych białek współoczyszczających, które nie były widoczne na żelu, w tym podjednostkę Omega polimerazy RNA oraz czynniki terminacji i determinacji transkrypcji, a także USA i NUSD. Z kolei w niezależnym eksperymencie białka aparatury mobilizacji siarki, SUFB, SUFC i SUFD, współoczyszczały się nawzajem, co wskazuje na ich wspólny udział w biosyntezie klastrów żelazo-siarkowych jako pojedynczego kompleksu rusztowującego. Ten reprezentatywny przykład podkreśla fakt, że wcześniej dobrze zbadane i szczegółowo opisane bakteryjne kompleksy MultiPro uczestniczące w istotnych procesach biologicznych często posiadają nowe powiązane komponenty, które mogą zostać wydajnie zidentyfikowane.

Stosując to podejście, niska liczba kopii białka SUFB mogła skutkować słabą intensywnością sygnału w porównaniu z silną intensywnością zaobserwowaną w eksperymentach pull down dla SUFC i SUFD. Aby zdefiniować skład stabilnych wielojednostkowych kompleksów białkowych, przypisano wyniki współoczyszczania do interakcji o wysokim stopniu ufności, biorąc pod uwagę unikalność relacji przynęta-ofiara, przynęta-przynęta oraz ofiara-ofiara. Następnie, wykorzystując procedury klastrowania grafów, takie jak algorytm klastrowania Markoffa, z partycjonowanej probabilistycznej sieci PPI zidentyfikowano dyskretne klastry białek.

Domniemane sieci oddziaływań można zwizualizować przy użyciu programu Cytoscape. Połączenie danych proteomicznych z dodatkowymi dowodami na powiązania funkcjonalne, wywnioskowanymi za pomocą metod genomicznych, może służyć do badania nowych ról mechanistycznych wcześniej adnotowanych białek e coli. W niniejszej pracy w e coli zdefiniowano podsieci kompleksów białkowych oraz moduły funkcjonalne, które uczestniczą w szerszych sąsiedztwach funkcjonalnych.

Główny hierarchiczny klaster Graham przedstawia wzorce przewidywań funkcjonalnych oraz istniejące adnotacje dla genów funkcjonalnie osieroconych i zcharakteryzowanych u e coli; kolory żółty i niebieski reprezentują odpowiednio funkcje istniejące i wnioskowane, natomiast intensywność odcieni odzwierciedla wyniki ufności. Procesy biologiczne powiązane z różnymi sąsiedztwami są wskazane po prawej stronie; wstawki pokazują poszczególne komponenty reprezentatywnego sąsiedztwa w oparciu o zintegrowane wyniki podobieństwa sieci interakcji fizycznych i funkcjonalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, w jaki sposób można izolować stabilne kompleksy białkowe z estia Coli, stosując metodę oczyszczania powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas.

Zasadniczo technikę tę można zastosować do charakterystyki kompleksów białek błonowych lub kompleksów białkowych z dowolnego innego gatunku, o ile możliwe jest ich rekombinowanie.