Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

W tym protokole wideo dowiedzą się Państwo, jak dysocjować tkankę płuc dorosłej myszy przy użyciu zestawu GentleMACS po uprzedniej dysocjacji tkanki płucnej. W obecności kolagenazy D i DNazy I zawiesiny komórkowe są filtrowane przez sitko komórkowe o rozmiarze 70 µm, wirowane i zawieszane do dalszych zastosowań. Witajcie, nazywam się Melanie Mlu z Miltenyi Biotec w Niemczech.

Dzisiaj zaprezentuję powtarzalną i zautomatyzowaną procedurę przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki płuca myszy przy użyciu systemu dysocjacji GenX. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do przygotowania zawiesin pojedynczych komórek w celu wyizolowania leukocytów lub komórek śródbłonka. Zatem zaczynajmy.

Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować kilka standardowych roztworów. Po pierwsze, będziemy potrzebować buforu Hebes. Po drugie, roztworu kolagenazy D zawierającego 100 mg/mL enzymu w buforze Hebes.

Po trzecie, roztwór dase one zawierający 20 000 jednostek na mililitr dase one. Na koniec dwa powszechnie stosowane roztwory buforowe: typowy bufor PBS o pH 7,2 oraz bufor PEB przygotowany z roztworu płuczącego AutoMax i roztworu zapasowego BSA.

Protokół rozpoczynamy od wypreparowanego płuca pobranego od samicy myszy biopsyjnej w wieku od sześciu do siedmiu tygodni. Należy upewnić się, że płuca są wolne od przylegających organów, takich jak serce i grasica, a także od naczyń krwionośnych odprowadzających i doprowadzających, tchawicy oraz tkanek łącznych. Tkankę płuczemy w szalce Petriego zawierającej PBS w celu usunięcia erytrocytów.

Zazwyczaj płuco myszy w tym wieku waży od 110 do 150 mg. Jeśli planujesz dysocjować płuca starszych zwierząt lub innych szczepów myszy, zważ tkankę i bufor. W jednej probówce można dysocjować maksymalnie 450 mg tkanki.

Przenieść tkankę płucną do rurki gentle max C zawierającej 4,9 milliliters buforu heis. Do tkanki płucnej i buforu dodać 100 microliters roztworu kolagenazy D do stężenia końcowego 2 milligrams per milliliter. Następnie dodać 10 microliters dase.

Jeden roztwór na więcej niż 150 mg tkanki. Dodać 20 µL roztworu dase one. Upewnić się, że probówka C jest szczelnie zamknięta, a następnie umieścić ją dnem do góry w urządzeniu gentle max dis.

Upewnij się, że tkanka znajduje się pomiędzy rotorem a statorem. Wybierz program dla płuc i uruchom go, naciskając przycisk start; po zakończeniu programu wyjmij probówkę typu C z urządzenia i inkubuj próbkę przez 30 minut.

Podczas inkubacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C probówkę należy obracać za pomocą rotatora Max Mix lub obracać ręcznie co pięć minut. Po inkubacji należy umieścić probówkę C z powrotem w urządzeniu Gentle Max Associator i uruchomić drugi program dla płuc. W czasie trwania programu należy przygotować probówkę o pojemności 50 mL do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując zakrętkę sitkiem komórkowym o oczkach 70 µm. Po zakończeniu programu dysocjacji, w zależności od rozkładu materiału próbki w probówce, można przeprowadzić krótkie wirowanie w celu skoncentrowania materiału próbki.

Rozdzielone komórki można usunąć z probówki, pipetując je przez zamkniętą septą zakrętkę probówki C. Przy użyciu odpowiedniego końcówki do pipety 1000 µl, zawiesinę komórkową nanosi się na sitko komórkowe w celu usunięcia większych cząsteczek lub agregatów. Po odcieknięciu roztworu należy przemyć sitko komórkowe, dodając dodatkowe 5 mL buforu HEES w temperaturze pokojowej, aby zebrać przefiltrowane komórki w osad.

Wiruj probówkę o pojemności 50 ml z prędkością 300 GS przez 10 minut. Następnie odessij nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w pożądanej objętości buforu PEB o temperaturze pokojowej.

Nie należy oddzielać nadsączu. Można teraz przejść do dalszych etapów analizy. Dysocjacja tkanki płuc myszy z zastosowaniem tej procedury pozwoli na uzyskanie wysokiego odsetka żywych leukocytów oraz komórek śródbłonka.

Otrzymane zawiesiny pojedynczych komórek barwiono przeciwciałami CD 45 PE, CD 1 46 FITC lub CD 31 FITC, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej. Wykres ten przedstawia wzbogacenie populacji komórek dendrytycznych przy użyciu mikrokulek CD 11 C, separatora minimax oraz dwóch kolumn MS. Właśnie zaprezentowałem sposób standaryzowanego przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy z wykorzystaniem delikatnej dysocjacji w systemie GentleMix oraz probówek C.

Metoda ta umożliwia wydajną dysocjację tkanki płucnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest prawidłowe wycięcie płuca i przetworzenie tkanki bezpośrednio po sekcji. Przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek mogą być następnie wykorzystane w dalszych eksperymentach.

Na przykład magnetyczne znakowanie komórek, a następnie separacja leukocytów lub komórek śródbłonka. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.