Antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł

Procedura ta rozpoczyna się od wykonania mikroelektrody na podłożu silikonowym. Na mikroelektrodzie i podłożu tworzona jest samoporządkująca się monowarstwa z glikolu polietylenowego, aby zapobiec osadzaniu się mikrotubul. Następnie przygotowywane są mikrotubule znakowane rubidyną.

Na koniec mikrotubule są rozmieszczane na elektrodach przy użyciu elektroforezy. Cześć, jestem John Noel z Nana Lab w Katedrze Fizyki oraz z Laboratorium Biomechaniki Molekularnej w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Texas A&M University. Jestem Wil free Teza z katedry fizyki i dyrektorem Center Skill Science and Technology na Texas A&M University.

Jestem Juan Quang, dyrektor Laboratorium Biomechaniki Molekularnej w Departamencie Inżynierii Biomedycznej na Texas A&M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wytwarzania mikroelektrod pokrytych nieprzywiercającą monowarstwą samoorganizującą się. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ruchu mikroprzewodów za pomocą elektroforezy.

Zacznijmy. W pierwszej kolejności należy użyć rysika lub przecinaka do wafli krzemowych, aby pociąć wafle krzemowe na kawałki o wymiarach 1 cm na 1,5 cm, które posłużą jako podłoża. Następnie należy oczyścić podłoża, umieszczając je w zlewce z ilością acetonu wystarczającą do ich całkowitego zanurzenia, i poddać sonikacji przez pięć minut, nie dopuszczając do wyschnięcia podłoży.

Opłucz je w świeżym acetonie, a następnie niezwłocznie ponownie opłucz w izopropanolu i osusz strumieniem azotu. Wykorzystując standardową fotolitografię pozytywową lub litografię wiązką elektronów, wykonaj złote mikroelektrody na czystych podłożach. Projektując geometrię wzoru, zachowaj średnicę każdego wzoru elektrody poniżej 100 µm. Aby zapewnić pokrycie przez samoorganizującą się monowarstwę trimetoksysilanu glikolu polietylenowego (peg Sam), uwzględnij pady kontaktowe umieszczone w odległości od 300 do 500 µm od wzoru, z linią o długości 1 mm łączącą pad z elektrodą.

Po wywołaniu wzoru w warstwie rezystu należy za pomocą pęsety wydrapać linię w rezyście od pola kontaktowego do krawędzi podłoża. Podczas osadzania metalu zadrapanie to umożliwi kontakt elektryczny między elektrodą a krawędzią podłoża. Do osadzania warstwy metalu wykorzystuje się komorę osadzania, najlepiej wyposażoną w dwa źródła.

Elektrody tworzy się poprzez osadzanie dwóch nanometrów chromu, a następnie sześciu nanometrów złota. Bez przerywania próżni do pomiaru grubości warstw podczas osadzania można wykorzystać kwarcową mikrowagę znajdującą się wewnątrz komory. Można teraz przystąpić do przygotowania samoporządkującej się monowarstwy w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, uprzednio rozgrzewając piekarnik do 75 °C. Przygotować roztwór do funkcjonalizacji, dodając 1 mL peg seliny do 20 mL toluenu w szklanym zlewce o pojemności 250 mL.

Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół od pięciu do 10 razy, a następnie mieszając pipetą przez 30 sekund. Umieść próbki z wzorem w zlewce stroną z wzorem do góry, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w roztworze i równomiernie rozmieszczone na dnie zlewki. Włóż zlewkę do pieca i wypalaj przez 18 do 21 godzin, podczas gdy formuje się Sam.

Przygotuj elektrodę przeciwprostną, nanosząc jedną nanometr chromu, a następnie cztery nanometry złota na szklane szkiełko nakrywki o wymiarach 22 na 50 milimetrów. Elektroda przeciwprostna powinna być niemal przezroczysta z jasnoszarą lub różową barwą. Przechowuj elektrodę przeciwprostną stroną pokrytą do góry w szalce Petriego, aby zachować jej czystość.

Po 18 do 21 godzin w piekarniku wyjmij zlew z piekarnika. Toluen powinien odparować, pozostawiając próbki wzoru w lepkim osadzie PEG. Do zlewka dodaj 20 ml toluenu i namaczaj próbki przez jedną do dwóch minut.

Wyjmij próbki z zlewki i opłucz je toluenem, następnie izopropanolem, a na koniec osusz azotem. Na tym etapie próbki powinny wyglądać na czyste, a warstwa Sam powinna być niewidoczna gołym okiem. Tak przygotowane Sam można wykorzystać w ciągu dwóch dni, przechowując je w chłodnych i suchych warunkach.

Nieudana formacja SAM prowadzi do powstania mętnej lub nierównomiernie zabarwionej warstwy osadu na powierzchni. Po przygotowaniu SAM możemy rozpocząć polimeryzację tubuliny w mikrotubule. Należy zacząć od rozmrożenia nieznakowanej tubuliny oraz tubuliny znakowanej rodaminą, a następnie niezwłocznie połączyć je w stosunku dwa do jednego (nieznakowana do znakowanej), aby uzyskać jasne mikrotubule.

Wymieszaj je dokładnie, kilkukrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie polimeryzuj tubulinę przez 20 do 40 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przygotuj bufor Taxol, mieszając 20 µM Taxolu z buforem pipee.

Wymieszać dokładnie, pipetując ciecz kilkakrotnie w górę i w dół oraz stosując wortex, a następnie umieścić probówkę w łaźni wodnej nagrzanej do 37 °C. Po polimeryzacji rozcieńczyć mikrotubule w ciepłym buforze Taxol i chronić je przed światłem. Zweryfikować, czy polimeryzacja mikrotubul przebiegła pomyślnie i czy mikrotubule pozostają stabilne podczas kilkuminutowego wzbudzania fluorescencyjnego.

Obrazuj przygotowane mikrotubule z zastosowaniem mieszaniny usuwającej tlen, gdy polimeryzacja tubuliny w mikrotubule zostanie zakończona. Przejdźmy do wzorowania MTS za pomocą elektroforezy. Aby zacząć, potnij dwustronną taśmę na cienkie paski, kładąc ją na szkiełku przedmiotowym i używając żyletki. Przyklej dwa paski taśmy dwustronnej w poprzek próbki pokrytej Sam, tak aby elektroda znajdowała się pomiędzy paskami, a ścieżka połączenia przebiegała prostopadle do taśmy.

Umieść elektrodę pomocniczą na dwustronnej taśmie klejącej, tak aby metalowa strona dotykała taśmy, a krawędź próbki wystawała poza elektrodę pomocniczą o około trzy milimetry. Odetnij kilka odcinków izolowanego miedzianego drutu magnetycznego o długości 15 centymetrów i usuń jeden centymetr izolacji z obu końców. Używając małej kropli farby srebrowej, przymocuj drut do odsłoniętego złotego obszaru podłoża, dbając o to, aby nie stworzyć kontaktu elektrycznego z elektrodą pomocniczą.

Teraz należy użyć farby srebrowej, aby przymocować drugi przewód do przeciwelektrody. Przewody elektrod przymocowane farbą srebrową można dodatkowo zabezpieczyć na próbkach za pomocą taśmy. Następnie, używając pipety, należy wprowadzić mikrotubule w wybranym rozcieńczeniu, obrazować je przy 20-krotnym powiększeniu i zlokalizować wzór na waflu krzemowym przed przyłożeniem napięcia.

Ze względu na głębokość komory przepływowej, do obrazowania jej górnej powierzchni mogą być potrzebne obiektywy z dużą odległością roboczą. Odległość od powierzchni próbki do górnej powierzchni komory przepływowej jest określona przez grubość taśmy i powinna wynosić około 60 do 100 micrometers. Przyłóż napięcie do 1 V i obserwuj migrację mikrotubul.

Jeśli pożądane jest odwracalne unieruchomienie mikrotubul, należy użyć lakieru do paznokci do uszczelnienia komory przepływowej, aby zapobiec dryfowi bocznemu, oraz stosować niższe napięcia, w zakresie do około 0,5 V. Migrację można śledzić, dostosowując pionową płaszczyznę ogniskowania mikroskopu; przy przyłożonym napięciu od około 0,9 do 1,2 V mikrotubule lokalizują się na powierzchniach elektrod.

Wyższe napięcie przyspieszy migrację i wzmocni adhezję, jednak zbyt wysokie napięcie wywoła elektrolizę i doprowadzi do depolimeryzacji. Mikrotubule: zaprezentowaliśmy właśnie sposób przygotowania mikroelektrod powlekanych SAM do wzorowania mikrotubul, ponieważ powłoka SAM zapobiega absorpcji mikrotubul na mikroelektrodach. Procedura ta może być również wykorzystana do odwracalnego wzorowania mikrotubul.

Ponadto proces ten nie ogranicza się wyłącznie do mikrotubul, lecz może być stosowany do wzorowania biomolekuł w ogóle. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.