Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest opracowanie dwuwymiarowo wzorowanego podłoża służącego do kontroli absorpcji białek oraz wzrostu komórek. Osiąga się to poprzez zastosowanie fotolitografii do wykonania wzorowanego matrycy, która służy do wytworzenia stempla A-P-D-M-S do mikrostemplowania. W drugim kroku przygotowywane jest wzorowane podłoże złote, co obejmuje mikrostemplowanie w celu stworzenia wzoru z obszarami absorbującymi oraz odpornymi na białka.

Następnie do podłoża dodaje się białka i komórki w celu wizualizacji wzoru i przeprowadzenia badań. Wyniki dotyczące wzrostu i zachowania komórek, uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz kontrastowej, wykazują dobre ograniczenie białek i komórek do obszarów wzoru na tych podłożach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak druk białek MicroCon, jest to, że monowarstwa zakończona grupami glikolowymi zapobiega nieswoistej adsorpcji białek i komórek w obszarach tła wzoru.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ właściwa technika stemplowania musi zostać zoptymalizowana dla każdego drukowanego wzoru. Aby rozpocząć przygotowanie wzorcowego centrum z wzorem, umieść wafle krzemowy na urządzeniu do powlekania rotacyjnego (spin coder) i w pierwszym kroku dwucyklowego programu wirowania przepłucz wafle acetonem. W drugim kroku programu wirowania aceton odparuje, pozostawiając czysty i suchy wafle; na początku wirowania nanieś na wafle fotorezist, a następnie wykonaj powlekanie rotacyjne zgodnie z wcześniej opisanymi warunkami.

Wstępnie wypal (soft bake) wafelek pokryty fotorezystem w temperaturze 110 °C przez dwie minuty, używając płyty grzejnej o wysokiej jednorodności. Następnie wykonaj naświetlanie wzoru. Wafelek pokryty fotorezystem poddaj procesowi przy użyciu systemu mask aligner oraz odpowiedniej maski.

W pierwszej kolejności umieść podłoże na stole próżniowym urządzenia do wyrównywania masek. Następnie włóż maskę do tacki uchwytu i włącz próżnię, aby unieruchomić maskę i zapewnić dobry kontakt między maską a podłożem. Podnieś podłoże, aż zetknie się ono z maską.

Użyj optyki urządzenia do wyrównywania, aby potwierdzić prawidłowy kontakt. Następnie włącz lampę, aby naświetlić podłoże światłem UV przez maskę litograficzną. Wywołaj wzorowany wafelek w wywoływaczu przez 1 minutę i 45 sekund przy delikatnym mieszaniu.

Dokładnie wypłucz wodą dejonizowaną klasy półprzewodnikowej i osusz strumieniem azotu, a następnie sprawdź rozwój wzoru za pomocą mikroskopu z filtrem UV. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania utwardzacza żywicy w stosunku masowym 10:1. Wymieszaj całkowicie z cigar 180 2.

Przykryj wafelek z wzorem fotograficznym mieszaniną w jednorazowej płytce Petri w suchym desykatorze próżniowym. Odgazuj matrycę pokrytą PDMS, aż do momentu, gdy nie będą widoczne żadne pęcherzyki powietrza. Upewniając się, że matryca znajduje się na dnie płytki, pozostaw stempel do utwardzenia w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 1,5 godziny. Po utwardzeniu stempla z PDMS, wytnij go z matrycy i przytnij do odpowiedniego rozmiaru.

Przechowywać stempel w zamkniętym pojemniku stroną roboczą do góry, aby chronić go przed kurzem i zanieczyszczeniami. Aby przygotować podłoża do osadzania metalu, najpierw poddać okrągłe szkiełka cover slips działaniu plazmy tlenowej przez 10 minut. Następnie dwukrotnie opłukać szkiełka wodą dejonizowaną, osuszając je strumieniem gazowego azotu pomiędzy płukaniami; po płukaniu wodą, dwukrotnie opłukać etanolem, ponownie osuszając strumieniem gazowego azotu pomiędzy płukaniami.

Używając wielokomorowego systemu naparowania wiązką elektronów, napać 50 angstromów tytanu, a następnie 150 angstromów złota. Nie wypuszczaj powietrza do komory naparowarki pomiędzy nanoszeniem warstwy tytanu a warstwy złota. Przepłucz stempel PDMS etanolem i dokładnie wysusz.

Używając gazu azotowego, nakładaj roztwór stemplujący na stempel kroplami, aż zostanie on całkowicie pokryty. Dokładnie wysusz stempel za pomocą gazu azotowego. Mikrodrukowanie kontaktowe n-hekzadekanu zależy od cech stempla PDMS i jest jednym z najtrudniejszych etapów tej procedury.

Skuteczne stemplowanie wymaga wypracowania właściwej techniki zapewniającej równomierny nacisk. Podczas stemplowania, w przypadku konwencjonalnego mikro druku kontaktowego w powietrzu, należy delikatnie docisnąć stempel do podłoża złotego i pozwolić na uformowanie się monowarstwy przez 15 sekund.

Alternatywnie, w przypadku wzorów składających się z bardzo małych elementów o wysokim współczynniku proporcji, należy umieścić złoty podłoże w szalce Petriego zawierającej wodę dejonizowaną o rezystywności 18,2 MΩ·cm, upewniając się, że podłoże jest zanurzone. Następnie należy delikatnie docisnąć stempel do złotego podłoża i pozwolić na utworzenie monowarstwy przez 15 sekund. Następnie podłoże po stemplowaniu należy dwukrotnie opłukać etanolem i wysuszyć strumieniem azotu.

Po każdym płukaniu umieść podłoże w szalce Petriego i pokryj je roztworem wypełniającym. Uszczelnij szalkę za pomocą param, aby zapobiec odparowywaniu. Pozostaw podłoże w ciemności przez 12 do 14 godzin w celu utworzenia monowarstwy tła.

Na koniec wyjmij wzorcowane szkiełko nakrywkowe z roztworu wypełniającego i przemyj je dwukrotnie etanolem, osuszając azotem po każdym płukaniu. Aby nanieść białko na wzorcowane szkiełko nakrywkowe, umieść je w małej szalce Petriego lub komorze do hodowli komórkowej. Przykryj szkiełko od 500 µL do 1 mL soli wodorowęglanu sodu w buforze fosforanowym (DPBS). DPBS musi całkowicie zakrywać podłoże podczas inkubacji białka.

Aby zapewnić równomierne pokrycie białkiem, należy dodać stężony roztwór białka do DPBS i wymieszać roztwór, kilkakrotnie pipetując go. Mieszaninę białka z podłożem inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Po inkubacji podłoże należy dokładnie wypłukać DPBS w celu usunięcia niezwiązanego białka, dbając o to, aby nie dopuścić do wyschnięcia podłoża ani do jego kontaktu z powierzchnią styku wody z powietrzem.

Po trzech płukaniach odessać DPBS. Następnie dodać około 500 µL kompletnej pożywki do hodowli komórkowej, aby utrzymać wilgotność podłoża. Wymienić pożywkę użytą do płukania podłoża.

Po dodaniu świeżej pożywki podłoże jest gotowe do wysiewu komórek. Zazwyczaj na podłoże wysiewa się od 30 do 200 komórek na milimetr kwadratowy. Na tym obrazie przedstawiono stempel A-P-D-M-S widoczny pod mikroskopem po przyłożeniu strony z wypukłością do szkiełka cover slip; pasek skali wynosi 100 micrometers.

Prawidłowe stemplowanie pozwala na uzyskanie ostrego, wyraźnego wzoru białkowego, który można zwizualizować poprzez naniesienie białka znakowanego fluorescencyjnie, takiego jak fibonektyna znakowana LOR 6 47. Tutaj przedstawiono ograniczenie komórek chk one do wzoru białkowego. Paski skali na tych obrazach wynoszą 100 micrometers.

Alternatywnie, do wizualizacji wzoru białkowego po unieruchomieniu SU można zastosować immunohistochemię. W tym przypadku zastosowano przeciwciało antylaminowe sprzężone z LOR 3 50 w celu wizualizacji wzoru laminy, na której zasiano neurony hipokampa myszy E 18, przedstawione w czwartym dniu in vitro. Neurony hipokampa myszy E 18 barwione MIT tracker red 5 80 wykazują, że wzrost komórek jest ściśle ograniczony do wzoru białkowego. Choć technika ta jest łatwa do opanowania, mogą wystąpić kilka typowych problemów, co ilustrują te preparaty substratu wzorzystego wizualizowane za pomocą absorpcji fibronektyny sprzężonej z LOR 6 47.

Nakładanie białka bez odpowiedniego wymieszania stężonego roztworu białka w DPBS może prowadzić do powstania nierównomiernych wzorów białkowych. Nieprawidłowe stemplowanie może skutkować częściowym przeniesieniem wzoru lub zapadnięciem się stempla. Ponadto wystawienie podłoża z wzorem zawierającym zaabsorbowane białko na działanie powietrza może zakłócić monowarstwę, co spowoduje spadek rezystancji.

W tle przedstawiono, że wzorowanie w zanurzeniu pozwala na uzyskanie wzorów z małymi elementami, których trudno jest wydrukować za pomocą konwencjonalnego mikrodruku stempelkowego w powietrzu. Te dwa obrazy przedstawiają różne obszary tego samego wzoru wykonanego przy użyciu tego samego stempla PDMS w powietrzu lub w wodzie dejonizowanej; linie pomocnicze widoczne na obrazie po lewej stronie pokazują, że jedynie małe elementy wzoru nie zostały wydrukowane pomyślnie. Paski skali wynoszą 20 micrometers. Po opanowaniu tej techniki cały proces może zająć od 18 do 24 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć sposób wytwarzania podłoża wzorowanego. Wykonaj stempel z PDMS. Wykorzystaj mikrokontaktowy druk do przygotowania wzorowanego podłoża złota i zwizualizuj ten wzór przy użyciu białek i komórek.