Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Przedstawione zostaną tutaj dwie techniki wizualizacji bijącego serca u Drosophila w celu wypreparowania serca dorosłego osobnika. Najpierw głowę i klatkę piersiową usuwa się za pomocą jednego cięcia wzdłuż zaznaczonej linii. Następnie usuwa się narządy kopulacyjne i otwiera jamę ciała odwłoka za pomocą pęsety; usuwa się jelita, a w przypadku samicy muchy również jajniki.

Ciało tłuszczowe w trzecim i czwartym segmencie odwłosa jest ostrożnie odsysane w celu odsłonięcia serca dorosłego osobnika dla unieruchomienia serca larwalnego. Pojedynczą larwę umieszczoną w roztworze buforowym unieruchamia się, nakładając najpierw klej histo acral wokół obszaru głowy larwy. Larwę delikatnie rozciąga się, a następnie nakłada więcej kleju na koniec tylny oraz na boki ściany ciała larwy.

Cześć, jestem GI Fler. Cześć, jestem Karen er. Oboje jesteśmy członkami programu Rozwoju i Starzenia w Instytucie Badań Medycznych Burnham.

Dzisiaj zaprezentujemy procedury, które opracowaliśmy w celu wizualizacji bijącego serca larw oraz dorosłych osobników Drosophila. Obie te preparacje wykorzystujemy jako metodę wizualizacji, badania i ilościowego określania parametrów tętna u muszki owocówki Drosophila. Przed rozpoczęciem prac przygotowujemy najpierw sztuczny roztwór hemolimfy.

Roztwór ten zawiera dodatek sacharozy, helo, który należy dodać do sztucznej hemolimfy z chłodniczych roztworów zapasowych bezpośrednio przed użyciem. Aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej, należy doprowadzić sztuczną hemolimfę do temperatury pokojowej i napowietrzyć roztwór poprzez bąbelkowanie powietrzem przez co najmniej 15 minut. Następnie, za pomocą standardowego wyciągacza kapilar, należy przygotować kilka cienkich kapilar, które będą potrzebne do usunięcia ciał tłuszczowych u muchy.

Po przygotowaniu wszystkich elementów należy znieczulić dorosłe muchy. Można to zrobić, poddając je krótkiemu działaniu środka do znieczulania much (fly nap) przez dwie do pięciu minut, jednak należy uważać, aby nie pozostawić much w tym środku dłużej niż przez pięć minut. Do znieczulenia much można również zastosować krótkotrwałe schłodzenie, natomiast nie zaleca się stosowania dwutlenku węgla, ponieważ wywiera on dłużej trwający wpływ na częstość akcji serca i aktywność.

Następnie znieczulone muchy umieszcza się grzbietem do dołu w szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowa kutykula skrzydeł i ciała powinna odwracalnie przylegać do wazeliny, jednak w razie potrzeby pozycję muchy można zmienić. Pierwsze cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych.

Zostaje to wykonane poprzez umieszczenie ostrzy nożyczek pod odnóżami muchy i skierowanie ich pod kątem w dół w stronę powierzchni grzbietowej w pobliżu szyi. Po wykonaniu cięcia głowa, brzuszny sznur nerwowy oraz odnóża zostają usunięte jednym ruchem. Następnie preparat zostaje zanurzony w natlenionym roztworze sztucznej hemolimfy przy użyciu nożyczek sprężynowych.

Koniec odwłoka, składający się z siódmego i ósmego segmentu brzusznego, zostaje usunięty jednym cięciem. Zapewnia to dostęp do wykonania cięć bocznych wzdłuż obu krawędzi odwłoka i służy do przerwania połączenia między jelitem tylnym a kutykulą odwłoka. Wprowadź ostrza nożyczek do niewielkiego otworu w końcówce odwłoka i przetnij kutykulę bocznie.

Uwalnia to jedną krawędź kutikuli brzusznej. Chwyć płat pęsetą i wykonaj podobne cięcie wzdłuż przeciwległej krawędzi bocznej odwłoka. Uwolniony płat brzusznej kutikuli odwłoka może teraz zostać usunięty.

Jelit i pozostałe narządy jamy brzusznej można zazwyczaj usunąć jako jedną masę, używając pęsety jubilerskiej i delikatnie pociągając. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą cewkę serca, która jest wciąż przymocowana do grzbietowej kutykuli za pomocą małych mięśni naczyniowych i otoczona ciałami tłuszczowymi. Wyciągnięte naczynia włosowate są wprowadzane do plastikowej rurki o średnicy 1/16 cala podłączonej do źródła próżni.

Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego po konfiguracji nie należy używać pipet z końcówkami o średnicy większej niż 40 mikronów. Ten system ssący służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Można go również wykorzystać do usuwania pęcherzyków powietrza gromadzących się wokół kutykuli oraz wszelkich zanieczyszczeń.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo krucha, należy unikać kontaktu z tym obszarem. Rurka serca dorosłej muszki owocówki jest teraz odsłonięta i w razie potrzeby powinna bić. Kutykulę wraz z przytwierdzonym sercem można ponownie ustawić, delikatnie unosząc kutykulę z wazeliny i ostrożnie przykładając ją z powrotem.

Należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z tkanką serca. Na tym etapie roztwór obmywający preparat należy zastąpić świeżą sztuczną hemolimfą. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek manipulacji należy pozwolić preparatowi na równoważenie przez 20 do 30 minut przy jednoczesnym natlenianiu.

Jeśli preparat ma być utrzymywany przez więcej niż 60 minut, należy go ponownie przepłukać świeżą sztuczną hemolimfą. Preparat jest teraz gotowy do rejestracji optycznej i może być również wykorzystany do rejestracji elektrofizjologicznej lub manipulacji histologicznych. Do wizualizacji bijącego serca wewnątrz larwy wymagana jest inna technika.

W pierwszej kolejności, dzień przed przystąpieniem do procedury, należy przygotować szkiełka nakrywki. W tym celu za pomocą wykałaczki przenosi się około 50 do 70 µL roztworu Sylgard na szkiełko nakrywkę o wymiarach 22 na 22 mm. Pozostawiono Sylgard do utwardzenia w temperaturze 65 °C przez noc.

Następnie przygotuj bufor Brody'ego i Batesa; po przygotowaniu alikwoty można przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać w razie potrzeby. Na koniec przygotuj narzędzia niezbędne do nałożenia kleju histoacral. Najpierw wyciągnij kilka cienkich kapilar.

Następnie połącz końcówkę pipety 1,5 ml z małą plastikową rurką o średnicy około 1/32 cala. Wkładając węższy koniec rurki do wnętrza końcówki, wprowadź kapilarę tak, aby jej szeroki otwór znajdował się po drugiej stronie. Po przygotowaniu układu napełnij kapilarę klejem histologicznym, zanurzając ją w kropli kleju i delikatnie zasysając go do plastikowej końcówki.

Podczas pracy z klejem należy mieć pod ręką drugą kapilarę szklaną, aby usunąć nadmiar kleju z końcówki kapilary dozującej. Klej pozostaje w stanie ciekłym do momentu kontaktu z roztworem soli fizjologicznej, w którym twardnieje w ciągu kilku sekund. Zazwyczaj jednak zachowuje on plastyczność wystarczająco długo, aby można było go usunąć z końcówki kapilary lub nanieść na preparat.

Aby rozpocząć unieruchamianie larw, nanieś kroplę kleju histo acral w pobliżu każdego narożnika syl guard. Do kropli kleju na szkiełkach podstawowych dodaj 50 µL buforu B and B, co spowoduje ich natychmiastowe utwardzenie, a następnie wypełnij przestrzeń między punktami klejenia buforem B and B. Klej utrzyma bufor na szkiełku.

Pobrać larwę w stadium L3 w fazie wędrówki i umieścić ją na kawałku zwilżonego ręcznika papierowego na lodzie na dwie minuty. Pozwoli to spowolnić jej ruchy. Następnie przenieść larwę do buforu i zorientować ją stroną grzbietową do góry.

Jest to strona larwy, która nie posiada identycznych pierścieni. Szybko nanieś niewielką ilość kleju pomiędzy obszarem głowy a osłoną progu. Klej bardzo szybko stwardnieje i zapobiegnie przemieszczaniu się głowy larwy.

Używając pincety, ostrożnie chwyć zwierzę za tylne kutykule i delikatnie je rozciągnij. Utrwal larwy w tej pozycji, nakładając klej wzdłuż obu stron tylnej połowy ciała. Aby ograniczyć dalszy ruch kutykuli wywołany przez mięśnie ściany ciała, nałóż więcej kleju na boki zwierzęcia.

Larwa jest teraz unieruchomiona w tej pozycji. Szkiełko podstawowe można umieścić w małej szalce Petriego wypełnionej sztuczną hemolimfą lub PBS, dzięki czemu można rejestrować bicie serca bez zakłóceń spowodowanych ruchami ścian ciała. Półzachowane serce dorosłej muszki *Drosophila* będzie bić rytmicznie przez wiele godzin po sekcji, pod warunkiem utrzymania go w świeżej, napowietrzonej sztucznej hemolimfie.

Reprezentatywny przykład pokazano tutaj oraz w filmie uzupełniającym nr 1; przedstawione tutaj serca larw trzeciego stadium oraz młodych much w wieku od jednego do trzech tygodni po wykluciu zazwyczaj wykazują regularne tętno o częstotliwości od 1 do 3 Hz. Muchy starsze niż trzy tygodnie są zazwyczaj bardziej arytmiczne. Niemniej jednak serca te nadal są zdolne do spontanicznego bicia przez wiele godzin w natlenionej sztucznej hemolimfie. Serca dorosłych much, które zostały uszkodzone w wyniku procedury sekcji, zazwyczaj wykazują zlokalizowane obszary ekstremalnego skurczu, które nie są w stanie się rozluźnić i często biją w sposób niekontrolowany. Częstotliwość tętna niższa niż 1 Hz jest rzadko obserwowana u much młodszych niż trzy tygodnie.

W konsekwencji takie preparaty uznaje się za uszkodzone i są one utylizowane. Właśnie zademonstrowaliśmy, jak przygotować serca muszki owocowej w stadium larwalnym oraz dorosłym do obrazowania optycznego. Pamiętaj, aby podczas przygotowywania preparatu półzachowawczego nigdy nie dotykać samego serca.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.