Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila
11 grudnia 2010
Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie embrionów oph i melanogaster do wizualizacji całego układu nerwowego. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie embrionów z interesującego nas szczepu muchy. Drugim krokiem procedury jest usunięcie chorionu za pomocą wybielacza.
Trzecim krokiem procedury jest zastosowanie heptanu i metanolu w celu usunięcia błony vilin. Ostatnim etapem procedury jest naniesienie przeciwciał na embriony. W rezultacie można uzyskać obrazy ukazujące strukturę układu nerwowego embrionu drosophila za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak rola, jaką mutacje mogą odgrywać w rozwijającym się układzie nerwowowym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ mogą przypadkowo wypłukać embriony z probówki. Protokół należy rozpocząć od przygotowania niezbędnych odczynników, w tym P-E-M-F-A, buforu PBC 5% BSA z 0,01% roztworem soli azku sodu oraz utrwalacza z formaldehydem.
Przygotuj klatkę dla wybranej linii muszek Drosophila, ogłuszając muchy dwutlenkiem węgla, a następnie przenosząc co najmniej 100 osobników do plastikowej butelki wyposażonej w adapter z pożywką agarową z sokiem jabłkowym. Umieść klatkę z muchami w ciemności w temperaturze pokojowej na 72 godziny. Wymieniaj płytki z pożywką agarową z sokiem jabłkowym co 8 do 12 godzin, aby muchy mogły zaaklimatyzować się w klatce i nie zatrzymywały jaj przed rozpoczęciem eksperymentu.
Po 72-godzinnym okresie aklimatyzacji należy zebrać embriony 12 godzin po ostatniej wymianie płytki z agarem z sokiem jabłkowym. Wyjąć płytkę z agarem z sokiem jabłkowym z klatki lęgowej i zastąpić ją roztworem soli fizjologicznej. Opłukać płytkę z agarem z sokiem jabłkowym.
Zebrać zarodki na gęstym sicie. Użyć czystego pędzla malarskiego, aby odczepić wszelkie zarodki, które pozostały przyklejone do płytki. Przepłukać zarodki na sicie solą fizjologiczną w celu usunięcia nadmiaru drożdży; za pomocą szpatułki delikatnie zebrać zarodki i przenieść je do małej szklanej fiolki.
Dodać około 1 ml roztworu soli fizjologicznej. Następnie zamknąć fiolkę i inkubować przez pięć minut w celu przemycia zarodków. Po zebraniu zarodków.
Przygotuj roztwór utrwalający w heptanie, łącząc 50% heptanu i 50% utrwalacza. Roztwór będzie posiadał dwie warstwy: heptan na górze i utrwalacz na dole. Po upływie pięciu minut użyj pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar soli fizjologicznej ze szklanej fiolki z embrionami.
Przepłucz zarodki wodą dejonizowaną, dodając około 1 ml wody dejonizowanej do szklanej fiolki zawierającej zarodki. Pozostaw zarodki na jedną minutę, a następnie usuń wodę i dodaj 50% roztwór wybielacza. Kilkakrotnie potrząśnij fiolką ręcznie, a następnie inkubuj przez trzy minuty, aby pokryć zarodki roztworem.
Zarodki zdegenerowane opadną na dno probówki. COR-y embrionalne będą unosić się na powierzchni. Po trzechminutowej inkubacji usunąć wybielacz oraz COR-y.
Po dekoracji dokładnie opłucz embriony wodą dejonizowaną, aplikując około 1 ml wody dejonizowanej do szklanej fiolki zawierającej embriony. Pozostaw embriony na jedną minutę, a następnie usuń wodę; pozostałości CORs będą unosić się na powierzchni i należy je usunąć. Dodaj do embrionów roztwór utrwalający w heptanie i inkubuj przez 30 minut przy łagodnym wstrząsaniu w celu ich utrwalenia.
Użyj pipety Pasteura, aby usunąć utrwalacz, który stanowi dolną warstwę, pozostawiając heptan w probówce. Następnie w miejsce utrwalacza dodaj do dna probówki metanol, zamknij probówkę i energicznie potrząśnij nią ręcznie, aby usunąć błonę witelinową. Po tym kroku zdezintegrowane embriony opadną na dno probówki.
Za pomocą pipety Pasteura usuń metanol i resztki z fiolki, pozostawiając zdeionizowane embriony. Następnie przemyj embriony pięciokrotnie metanolem, usuwając metanol pipetą Pasteura po każdym płukaniu. Podczas każdego płukania inkubuj embriony przez pięć minut.
Umieść embriony w mieszaninie 50% roztworu PBT i 50% metanolu na pięć minut w celu ich rehydratacji. Następnie kontynuuj proces rehydratacji, przenosząc je do 100% roztworu PBT na pięć minut. Następnie zablokuj embriony, inkubując je w 5% roztworze BSA z 0,01% azotkiem sodu przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie należy przygotować przeciwciało pierwotne do barwienia zarodków, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5%BSA z dodatkiem 0,01% azydku sodu. Zastosowane tutaj przeciwciała są skierowane przeciwko pęcherzykowemu białku cysteinowemu (vesicular cysteine string protein) oraz są to przeciwciała anty-HRP. Przeciwciała anty-HRP rozpoznają specyficzny dla neuronów fragment węglowodanowy obecny w glikoproteinach powierzchniowych, co pozwala na znakowanie wszystkich neuronów.
Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4 °C w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego. Przemyć zarodki 10 razy w roztworze PBT w ciągu godziny. Nalać około 1 ml PBT do szklanej fiolki z zarodkami i pozostawić je w roztworze na sześć minut przed jego usunięciem.
Powtórz ten proces nakładania PBT, inkubacji i usuwania PBT 10 razy. Przygotuj roztwór przeciwciał wtórnych w ciemności, ponieważ są one światłoczułe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia. Stosujemy przeciwciała wtórne Alexa w stężeniu 1:200.
Inkubować zarodki przez dwie godziny w temperaturze 4°C w roztworze przeciwciał wtórnych. Szklaną fiolkę z zarodkami i roztworem przeciwciał wtórnych owinąć folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Przemyć zarodki 10 razy za pomocą PBT w ciągu godziny.
Do embrionów dodać medium montażowe Vector Shield i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C w celu zamocowania. Za pomocą pipety Pasteura pobrać embriony wraz z niewielką ilością medium montażowego. Nanieść embriony i medium na szkiełko przedmiotowe.
Nałóż szkiełko cover slip na zarodki i uszczelnij je lakierem do paznokci. Wizualizację zarodków przeprowadź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. OUN zarodkowy pokazano w stadium od 16 do 17.
Białko cystynowy sznur (cystine string protein) zaznaczono na czerwono. Neurony HRP zaznaczono na zielono. Należy zwrócić uwagę na wyraźne barwienie komisury na tym reprezentatywnym obrazie.
Zarodekowy PNS pokazano w stadium 16 do 17. Ponownie białko cystine string zaznaczono kolorem czerwonym, a neurony kolorem zielonym. Zwróć uwagę na powtarzalne wzorce neuronów obwodowych.
Podczas wykonywania tej procedury należy uważać na embriony, aby nie usunąć ich przypadkowo z probówki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania embrionów oph fla do wizualizacji całego układu nerwowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółową procedurę przygotowania embrionów Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy. Metoda obejmuje kilka etapów, w tym zbieranie embrionów, fiksację oraz barwienie przeciwciałami, co w końcowym etapie umożliwia obserwację struktur neuronalnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Embriologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie embrionalnego układu nerwowego jest kluczowe dla poznania procesów rozwojowych.
- Wizualizacja struktur neuronalnych może pomóc w wyjaśnieniu efektów mutacji genetycznych.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna to potężna technika badania komponentów komórkowych.
- Prawidłowe przygotowanie embrionów jest niezbędne dla uzyskania pomyślnych wyników obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu wizualizacji układu nerwowego w embrionach Drosophila.
- Ułatwienie badań nad rolą mutacji w rozwoju układu nerwowego.
- Pogłębienie wiedzy na temat struktury neuronów embrionalnych dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik obrazowania.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie embrionów z określonych szczepów Drosophila.
- Zastosowanie wybielacza i heptanu do usuwania błon i fixacji.
- Użycie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych do specyficznego barwienia.
- Wizualizacja embrionów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w stadium 16.
- Demonstracja efektywności protokołu barwienia przeciwciałami.
- Wgląd w organizację strukturalną neuronów w rozwijających się embrionach.
- Identyfikacja potencjalnych trudności dla nowych badaczy stosujących ten protokół.
Wnioski
- Opisany protokół przedstawia kompleksową metodę badania układów nerwowych embrionów Drosophila.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna została zwalidowana jako skuteczne narzędzie w tych badaniach.
- Dalsze prace mogą wykorzystać tę metodę do badania wpływów genetycznych na rozwój układu nerwowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila umożliwia wysokorozdzielczą analizę rozwoju neuronów oraz perturbacji genetycznych. Niniejszy schemat postępowania wspiera wczesny etap walidacji celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez bezpośrednią wizualizację architektury neuronalnej i fenotypowych skutków mutacji. Podejście to jest strategicznie ukierunkowane na selekcję projektów w ramach portfela badań oraz zwiększenie pewności predykcyjnej w procesach badawczych nad neurorozwojem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę fenotypów neuronalnych w odpowiedzi na modyfikacje genetyczne.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów neurorozwojowych poprzez wizualizację z użyciem przeciwciał.
- Ułatwia minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie aberracyjnych wzorców układu nerwowego z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Zapewnia solidną platformę do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków rozwojowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Ustanawia powtarzalny system ilościowej wizualizacji struktur neuronalnych.
- Standaryzuje detekcję z użyciem przeciwciał w celu późniejszego przesiewania perturbacji genetycznych lub chemicznych.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie embrionów do procesów obrazowania o wysokiej zawartości informacji (high-content imaging).
- Dostarcza ilościowe wyniki odpowiednie do analizy porównawczej między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób, umożliwiając wizualizację wad neurorozwojowych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych do walidacji przedklinicznej w neurobiologii.
- Dostarcza punktów końcowych fenotypowych dla dostosowanego do ryzyka wdrażania związków neuroaktywnych.
- Zwiększa wartość prognostyczną dla identyfikacji translacyjnych biomarkerów w neuronauce rozwojowej.
Integracja potoków przetwarzania i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, obejmujący etapy od wczesnego testowania hipotez genetycznych, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację modeli przedklinicznych w badaniach nad rozwojem neurologicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych poprzez umożliwienie wizualizacji zmian w wzorcach neuronalnych po manipulacjach genetycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki obrazowania do porównawczego przesiewania efektów fenotypowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty oparte na przeciwciałach do rzetelnej analizy statystycznej rozwoju neuronów.
- Badania translacyjne: Łączy etapy odkrywcze i przedkliniczne poprzez dopasowanie wyników fenotypowych do punktów końcowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań nad rozwojem neurologicznym w wielu liniach genetycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neurorozwojowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy dla wizualizacji neuronów z wykorzystaniem przeciwciał.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez zapewnienie wczesnej przejrzystości fenotypowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów neurorozwojowych i związków z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z Drosophila oraz w mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania fluorescencyjnego i zwalidowanych odczynników przeciwciał.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów określania stadium rozwoju zarodków oraz barwienia w ramach całego zespołu.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych tła genetycznych lub etapów rozwoju.
- Staranne obchodzenie się z zarodkami jest kluczowe, aby uniknąć utraty próbek i zapewnić powtarzalność.
