Analiza odporności wywołanej przez wzorce molekularne związane z patogenami (PTI) u roślin

Witam, nazywam się Suma TI i pracuję w laboratorium Grega Martina w Voice Thompson Institute for Plant Research. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę testu opartego na śmierci komórek w celu badania odporności wyzwalanej przez PAM, znanej jako PTI. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby badać udział konkretnego genu w procesie PTI.

Zacznijmy zatem. Procedurę rozpoczynamy od hodowli roślin Nicotiana ANA do momentu, gdy osiągną około siedmiu tygodni wieku. Cztery do pięciu dni przed rozpoczęciem.

Test odporności wywołanej przez PAM lub PTI. Przytnąć rośliny, usuwając wszystkie pędy boczne oraz kwiaty. Należy starać się usuwać pędy boczne wkrótce po ich pojawieniu się, aby ułatwić pielęgnację roślin.

Po przygotowaniu roślin należy przystąpić do hodowli bakterii. Procedura ta wykorzystuje bakterie niepatogenne do indukcji odporności roślin przed drugim zaszczepieniem bakteriami wywołującymi chorobę; należy rozpocząć hodowlę wszystkich bakterii używanych w teście. Jednocześnie, dla każdego szczepu bakterii z rodzaju Pseudomonas, należy wykorzystać zamrożone stokki glicerolowe.

Nanieś niewielką ilość bakterii na środek płytki KBM zawierającej odpowiedni antybiotyk i inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez około 18 do 24 godzin. W przypadku agrobakterii użyj wcześniej przygotowanej świeżej płytki, aby rozpocząć hodowlę w cieczy w 2 mL LB. Hoduj przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem do następnego dnia.

Do płytek z bakteriami z rodzaju Pseudomonas dodać od 150 do 200 µL ciekłego podłoża KBM. Rozprowadzić bakterie po całej powierzchni płytki, używając sterylnego rozprowadzacza.

Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na kolejne 20 do 24 godzin. Dla agrobacterium rozpocznij hodowlę wtórną w około 5 do 10 ml pożywki LB zawierającej 20 µM acetonu.

Kulturę inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Po przygotowaniu bakterii, na dzień przed przeprowadzeniem testu PTI, przystąpić do przygotowania roślin do analizy. Po przygotowaniu bakterii przenieść rośliny do pomieszczenia o temperaturze 22 do 24 °C, wilgotności względnej około 35 do 40% i stałym oświetleniu.

Następnie, za pomocą grubego czarnego markera, zaznacz okręgi na liściach. Wybieraj liście dobrze rozwinięte, unikając liści starszych oraz tych, które w dotyku są twarde lub grube. Unikaj zaznaczania dolnych części liścia.

Okręgi mają średnicę co najmniej 1,5 cm i na każdym liściu można zaznaczyć od dwóch do czterech takich okręgów. Okręgi powinny być rozmieszczone w odpowiednich odstępach i najlepiej nie powinny przecinać dużych żyłek. Analizę PTI należy rozpocząć od zebrania bakterii wykorzystywanych do indukcji PTI.

Użyte gatunki Pseudomonas powinny utworzyć trawnik bakteryjny świadczący o dobrym wzroście. Zebrać je z płytki, zdrapując sterylnym, długim drewnianym patyczkiem, a następnie zawiesić w około 20 do 25 mililitrów 10 milimolarnego roztworu chlorku magnezu do wirowania Agrobacterium.

Kulturę należy zebrać, a komórki zawiesić w około 20 do 25 ml 10 mM chlorku magnezu oraz 10 mM MES pH 5,6. Następnie należy powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad w około 20 do 25 ml roztworu chlorku magnezu z MES. W tym momencie bakterie Pseudomonas oraz Agrobacterium indukujące zostały zawieszone.

Zmierz gęstość optyczną wszystkich trzech kultur przy długości fali 600 nanometrów. Skoryguj wartość OD, rozcieńczając komórki w roztworze chlorku magnezu w przypadku pseudomonas oraz w buforze MES z dodatkiem chlorku magnezu w przypadku agrobacterium. Wymagane końcowe wartości OD znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym.

Objętość 25 mililitrów kultury bakterii jest wystarczająca do inokulacji około 40 do 50 punktów. Teraz należy rozpocząć test, infiltrując induktory PTI do wcześniej zaznaczonych okręgów na liściach, używając jednofunkcyjnej strzykawki o pojemności jednego mililitra bez igły. Należy zapisać kolejność infiltracji roślin oraz dokładną godzinę rozpoczęcia infiltracji po indukcji.

Przystąp do inokulacji wyzwaniem kilka godzin po inokulacji indukującej. Zbierz szczepy bakteryjne wymagane do inokulacji wyzwaniem w sposób opisany wcześniej dla indukujących szczepów Pseudomonas. Ponownie zmierz OD i dostosuj stężenie kultur zgodnie z towarzyszącym protokołem GR.

Inokulację testową należy rozpocząć siedem godzin po infiltracji induktorem. Należy zastosować następujące kombinacje induktora i patogenu. Jako środek drugiego kręgu inokulacji należy wybrać punkt na obwodzie pierwszego kręgu inokulacji.

Przeprowadź infiltrację wyzwaniem w tej samej kolejności roślin, w jakiej przeprowadzono indukcję. W przypadku wielu punktów na liściu należy upewnić się, że miejsca infiltracji nie nakładają się na siebie. Na koniec wysiej rozcieńczenia seryjne wszystkich kultur użytych w teście na płytki KBM lub LB zawierające odpowiednie antybiotyki.

Dwa dni po inokulacji wyzwaniem można rozpocząć ocenę odpowiedzi PTI. Dwa dni po indukcji i inokulacjach wyzwaniem należy sprawdzić występowanie śmierci komórek wywołanej odpornością sterowaną efektorami (ETI) w miejscach poddanych inokulacji PST DC 3000. Śmierć komórek w obszarze nakładania się infiltracji wskazuje na załamanie PTI i powinna zostać oceniona jako fenotyp pozytywny. Od czterech do pięciu dni po indukcji i inokulacjach wyzwaniem należy sprawdzić występowanie śmierci komórek spowodowanej chorobą w miejscach poddanych inokulacji mutantem DC 3000 hop Q1 lub PS back high. Ponownie należy szukać załamania PTI, które objawia się śmiercią komórek spowodowaną chorobą w obszarze nakładania się infiltracji. Obserwację roślin należy kontynuować do momentu, aż te, w których PTI nie zostało upośledzone, zaczną wykazywać śmierć komórek w obszarze nakładania się infiltracji.

Rośliny z wyciszonym genem FLS wykazują upośledzoną odpowiedź PTI dwa dni po inokulacji kombinacją PFDC. Śmierć komórek jest widoczna w obszarze nakładania się, co wskazuje na załamanie kontroli PTI. Rośliny kontrolne, w których nie wyciszono żadnego genu, również zostały poddane inokulacji kombinacją PFDC i zbadane dwa dni po przeprowadzeniu testu; śmierć komórek wywołana bodźcem jest widoczna poza obszarem nakładania się, ale nie w jego wnętrzu, co wynika z prawidłowej odpowiedzi PTI.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia testu opartego na śmierci komórek w celu badania odporności wywołanej przez wzorce (PTI). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać rośliny w zalecanych warunkach środowiskowych. Wyższy poziom wilgotności mógłby negatywnie wpłynąć na rośliny i przyspieszyć przebieg testu.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.