Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

W niniejszej procedurze obrazowanie liści jest wykorzystywane do oceny ruchu szparek w odpowiedzi na żywe komórki bakteryjne. Najpierw bakterie są hodowane z zapasu w glicerolu i przygotowywany jest inokulum. Następnie zbiera się młode, zdrowe liście i barwi je jodkiem propidium.

Barwione liście są wycinane, a fragmenty liści inkubowane na powierzchni zawiesiny bakteryjnej. Na koniec powierzchnię liścia obserwuje się pod mikroskopem, co pozwala na pomiar szerokości szparek aparatów szparkowych. Wyniki uzyskane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej wykazują zmiany w szerokości szparek w odpowiedzi na obecność bakterii.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie peelingów epidermalnych, jest to, że liść w kontakcie z bakteriami pozostaje nienaruszony, co naśladuje naturalne warunki penetracji bakterii do liści. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej nasiona Arabidopsis na mieszankę podłoża do wzrostu z wermikulitem w proporcji 1:1:1. Hoduj rośliny w komorze wzrostowej i podlewaj w razie potrzeby.

Rośliny są gotowe do użycia po czterech do sześciu tygodniach, gdy posiadają młode, całkowicie rozwinięte liście przed wyrzuceniem pędu kwiatostanowego. Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować posiew bakterii. Pseudomonas ringe należy wyizolować z banku w glicerolu na zmodyfikowanym podłożu LB i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 28 °C.

Do przygotowania inokulum należy użyć świeżej kultury, a hodowle na płytkach zawsze rozpoczynać od banków glicerolowych. Ponieważ bakterie tracą zjadliwość po kolejnych pasażach, należy wykorzystać bakterie z płytki do zaszczepienia 10 ml kultury płynnej pseudomona singe. Kulturę inkubuje się przez noc w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml w temperaturze 28 °C przy intensywnym wstrząsaniu, aż do osiągnięcia gęstości optycznej (OD) przy 600 nm w przedziale od 0,8 do 1.

Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie z prędkością 1 360 ×g przez 10 minut. Resuspenduj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowe OD wynosiło 0,2. Ta wartość OD odpowiada 10⁸ jednostkom tworzącym kolonie na mililitr.

Po przygotowaniu bakterii należy przystąpić do przygotowania liści i przeprowadzenia testu w celu ich zabarwienia. Najpierw należy przygotować 20 µM roztwór jodku propidyny (PI) w wodzie. 10 mL roztworu wystarczy do jednorazowego zabarwienia trzech małych liści.

Wyjąć rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pęsety odłączyć trzy młode, w pełni rozwinięte liście. Zanurzyć całe liście w roztworze PI na pięć minut. Następnie wyjąć liście i krótko opłukać je wodą destylowaną.

Następnie należy umieścić liść na szkiełku przedmiotowym stroną spodnią do dołu. Za pomocą ostrego ostrza brzytwy podzielić liść na cztery części, omijając żyłkę główną, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka, co umożliwi inkubację bakterii z tkankami liścia. Pod fragmenty liścia na szkiełku dodać 300 µL zawiesiny bakteryjnej, upewniając się, że spodnia powierzchnia liścia styka się z inokulum.

Inkubuj próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W momencie rozpoczęcia obserwacji liści pod mikroskopem, przenieś fragmenty liści na nowy szkiełko przedmiotowe, tak aby ich dolna powierzchnia była skierowana do góry. Należy pamiętać, że podczas przygotowywania preparatów nie stosuje się szkiełek nakrywkowych.

Tę samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji, a przebieg czasowy można ustalić zgodnie z celami badawczymi. W tym przypadku do badania liści wykorzystuje się konfokalny skaningowy mikroskop laserowy, obserwując dolną powierzchnię liści w celu wykrycia fluorescencji PI przy użyciu tych samych próbek liści oraz rejestrując obrazy aparatów szparkowych w czasie. Zapisz obrazy, aby zmierzyć szerokość szczeliny szparkowej.

Zmierz szerokość szczeliny aparatów szparkowych dla co najmniej 60 szparek dla każdej serii badawczej w każdym punkcie czasowym. Używając przeglądarki obrazów LSM, oblicz średnią oraz błąd standardowy dla szerokości szczeliny szparkowej. Istotność statystyczną wyników można obliczyć przy użyciu dwustronnego sparowanego testu t-Studenta.

Przedstawiony tutaj obraz jest typowym zdjęciem mikroskopowym powierzchni liścia arabidopsis wykonanym za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. W obrazowaniu w polu jasnym jodek propidyny barwi ściany komórkowe żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szparkowych, a ponadto pozwala na identyfikację nieuszkodzonych komórek. Na tych mikrografach widoczny jest zakres stopnia otwarcia szparek aparatów szparkowych, od całkowicie zamkniętych do szeroko otwartych.

Całkowicie zamknięte szparki rozpoznaje się po kształcie komórek szparkowych. W przypadku szparek otwartych szerokość otworu przyjmuje się za zero mikrometrów. Przedstawiona szerokość otworu jest mierzona za pomocą linii prostej przeprowadzonej przez najszerszy obszar otworu szparkowego.

Są to typowe wyniki eksperymentalne testu inokulacji żywych liści. Liście Arabidopsis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami pseudomonas Cy Ringe; tylko bakteria P-S-T-D-C 3000 była w stanie otworzyć szparki w ciemności, co zmierzono na podstawie szerokości apertury 60 losowo wybranych szparek na szczep bakteryjny. Technika ta otworzyła przed badaczami z dziedziny zaplanowanych interakcji bakteryjnych drogę do zgłębiania mechanizmów wczesnej odpowiedzi na patogeny u gatunków roślin.