Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Niniejsza procedura rozpoczyna się od cDNA zsyntetyzowanego z wysokiej jakości matrycy RNA. cDNA jest najpierw znakowane barwnikiem fluorescencyjnym Cy3. Po zakończeniu reakcji znakowania, znakowane cDNA jest oczyszczane, izolowane, a następnie oceniana jest jakość reakcji znakowania.

Oznaczone cDNA jest następnie hybrydyzowane z mikromacierzą. Po hybrydyzacji macierze są analizowane w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach. Witajcie, nazywam się Sam Peterson i pochodzę z laboratorium dr Jennifer Freeman z School of Health Sciences na Purdue University.

Wcześniej pokazaliśmy Państwu, jak wyizolować RNA z embrionów danio pręgowanego i przekształcić to RNA w cDNA. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania i hybrydyzacji tego cDNA na platformie mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego w celu badania globalnych profili ekspresji genów. Zazwyczaj stosujemy tę procedurę do badania różnicowej ekspresji genów w odpowiedzi na ekspozycję na toksynę.

Zacznijmy zatem. Eksperyment z mikromacierzą wymaga środowiska o minimalnym oświetleniu, aby zapobiec fotodegradacji barwnika fluorescencyjnego Cy3 używanego do znakowania. Aby rozpocząć znakowanie cDNA za pomocą Cy3, rozmroź następujące komponenty zestawu BioPrime Array CGH Genomic Labeling System: 2,5x bufor z randomowymi starterami, 10X mieszankę dNTP oraz wodę wolną od nukleaz. Dodatkowo rozmroź zapasowy roztwór dCTP znakowanego Cy3 o stężeniu 1 mM. Po rozmrożeniu krótko odwiruj odczynniki w wirówce i połącz je w grubościennej probówce o pojemności 0,6 ml.

500 ng cDNA w 40 µL, 2,5 x bufor do starterów randomowych oraz wodę wolną od nukleaz do uzyskania całkowitej objętości 86 µL. Dobrze wymieszać i krótko odwirować, następnie inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 100 °C przez pięć minut. Po zakończeniu inkubacji natychmiast przenieść reakcję do kąpieli lodowej na 10 minut.

Następnie wyjmij polimerazę DNA exo z zamrażarki i umieść na lodzie. Następnie do probówki z reakcją dodaj 10 µL mieszanki 10 X-D-C-T-P, 2 µL 1 mM SI 3D CTP oraz 2 µL polimerazy DNA XO cleanout, wymieszaj dokładnie i krótko odwiruj w wirówce. Na koniec inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termocyklerze, aż etykietowanie zostanie zakończone.

Przejdź do oczyszczania i precypitacji znakowanego cDNA. Aby rozpocząć oczyszczanie znakowanego cDNA, umieść kolumnę MicroCon w probówce 1,5 ml.

Dodaj 300 µL 0,1 XSSC do kolumny, a następnie dodaj mieszaninę reakcji znakowania. Wirowarkuj kolumnę z prędkością 16 100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zauważ, że frakcja przepływowa może mieć jasnoróżowy kolor.

Odrzuć frakcję przepływową i dodaj do kolumny kolejne 300 µL 0.1 X SSC. Następnie powtórz wirowanie przy 16 100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie odrzuć frakcję przepływową i dodaj do kolumny dodatkowe 300 µL 0.1 X SSC, a po tym ostatnim płukaniu wiruj przy 16 100 g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.

Przesącz powinien być klarowny, a różowo znakowane cDNA powinno być widoczne na kolumnie. Ponownie odrzuć przesącz z tego ostatniego przemywania, aby usunąć znakowane cDNA. Dodaj 100 µL wody wolnej od nukleaz do kolumny. Wyjmij kolumnę z probówki do mikrowirówki i odwróć ją do nowej probówki.

Następnie odwiruj odwróconą kolumnę z prędkością 2,300 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oznakowany CDNA rozpuszcza się w wodzie znajdującej się na dnie probówki. Sprawdź uzyskany CDNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000 zgodnie z instrukcjami producenta.

Oblicz stężenie DNA i oceń stopień wbudowania barwnika zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Jeśli cDNA jest wystarczająco znakowane, przenieś 6 µg do nowej probówki, aby wyprecypitować mieszaninę znakowanego cDNA, dodając 0,1 x objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 1 x objętości izopropanolu, a następnie inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Należy pamiętać, że wszystkie dotychczasowe etapy były przeprowadzane w warunkach minimalnego oświetlenia. Następnie próbkę wiruje się przy 16 100 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu ostrożnie odrzuca się nadsącz, nie naruszając różowego osadu DNA.

Na koniec przemyto próbkę, dodając 500 µL 70% etanolu, wymieszano metodą delikatnego odwracania i wirowano przy 16 100 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usunięto nadsącz, odwrócono probówkę i pozostawiono osad do wyschnięcia na pięć minut. Znakowane cDNA jest gotowe do hybrydyzacji.

Przed rozpoczęciem hybrydyzacji włącz system hybrydyzacji NimbleGen i poczekaj, aż osiągnie temperaturę równowagi 42 °C. Rozpocznij od rozpuszczenia pelletu znakowanego cDNA w 5 µL wody wolnej od nukleaz. Do rozpuszczonego pelletu dodaj komponenty hybrydyzacyjne z zestawu Roche NimbleGen Hybridization Kit: bufor hybrydyzacyjny Hybrid A oraz oligo wyrównujący, tak aby uzyskać całkowitą objętość 18 µL, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole pisemnym.

Wymieszać dokładnie i krótko wirować probówkę, aby zebrać zawartość na dnie. Następnie zdenaturować znakowane cDNA, umieszczając probówkę w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Natychmiast przenieść probówkę do systemu hybrydyzacji NimbleGen, aż macierze będą gotowe.

Należy pamiętać, że macierze mikroarray wymagają ostrożnego obchodzenia się i przechowywania. Macierze Roche nimble gen przechowuje się w ciemności z osuszaczem w temperaturze pokojowej. Włóż macierz do narzędzia do wyrównywania mieszadła precyzyjnego.

Załaduj mieszadło X do PMA T i za pomocą pęsety usuń pasek klejący. Po załadowaniu matrycy i mieszadła szczelnie zamknij PMA T. Następnie odłącz matrycę i mieszadło od PMA T, naciskając mieszadło przez otwór w PMA T.

Na koniec za pomocą wałka dociskowego wywrzyć nacisk wokół zewnętrznej krawędzi miksera, aby upewnić się, że matryca jest szczelna i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie umieścić kompleks miksera matrycy w systemie do hybrydyzacji w celu podgrzania i naniesienia próbki cDNA na matrycę. Tłok przesuwać powoli, wywierając stały nacisk.

Dodaj 15 µL oznakowanej próbki do otworu wlewowego w centrum miksera. Wytrzyj nadmiar próbki z otworów i zamknij je za pomocą pasków samoprzylepnych. Następnie zamknij zatrzask.

Następnie rozpocznij mieszanie roztworu hybrydyzacyjnego, korzystając z programu B w systemie do hybrydyzacji nimble gen. Pozostaw mikromacierz do hybrydyzacji na okres od 16 do 20 godzin. Po zakończeniu procesu mikromacierz zostanie przemyta i zeskanowana; gdy hybrydyzacja będzie dobiegać końca, przygotuj się do skanowania, włączając skaner macierzy gene picks 4, 000 B i pozostawiając go do rozgrzania przez około 15 minut.

Następnie przygotuj bufory do płukania 1 A, 1 B, 2 i 3 zgodnie z opisem w załączonym protokole pisemnym. Podgrzej bufor do płukania 1 A do 42 °C, natomiast pozostałe bufory pozostaw w temperaturze pokojowej. Po ogrzaniu buforu do płukania 1 A przelej go do naczynia.

Zanurz kasetę na szkiełka w buforze płuczącym one B. Następnie wyjmij kompleks miksera matrycy z systemu hybrydyzacji nimble gen i wsuń go do uchwytu. Rozpocznij płukanie, zanurzając zespół w uprzednio podgrzanym buforze płuczącym one A, a następnie ostrożnie usuń mikser, odklejając go od szkiełka. Po tym wyjmij matrycę z uchwytu i agituj przez 15 sekund w buforze płuczącym one A. Szybko przenieś matrycę do kasety na szkiełka zanurzonej w buforze płuczącym one B i energicznie agituj kasetę przez dwie minuty.

Następnie przenieś kasetę z preparatami do drugiego buforu płuczącego i agituj przez jedną minutę. Na koniec przenieś kasetę z preparatami do trzeciego buforu płuczącego i agituj przez 15 sekund. Zakończ etap płukania, przenosząc matrycę do wirówki do suszenia preparatów i wirując przez dwie minuty.

Niezwłocznie zeskanuj matrycę, ponieważ D jest wrażliwe na światło i ozon. Rozpocznij skanowanie, ładując matrycę kodem kreskowym skierowanym w dół do skanera matryc gene picks 4, 000 B. W oknie dialogowym ustawień sprzętu ustaw wartość PMT dla lasera 532 nanometer na 500, moc na 100%, rozmiar piksela na pięć mikronów, liczbę linii do uśrednienia na jedną oraz pozycję ogniskowania na zero mikronów. Po zakończeniu konfiguracji wykonaj podgląd matrycy.

Wybierz obszar do skanowania, a następnie go zeskanuj. Po zakończeniu skanowania sprawdź histogram obrazu. Idealnie, wartość 1 E-5 znormalizowanych zliczeń powinna znajdować się na granicy nasycenia 65 000, co oznacza, że nasyconych jest około 1 do 2% cech.

Jeśli znormalizowane zliczenia są mniejsze niż 1E-5, należy zwiększyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować preparat. Jeśli znormalizowane zliczenia są większe niż 1E-5, należy zmniejszyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować preparat, zapisać obraz, a następnie użyć programu do analizy danych w celu normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności. Reakcja znakowania rutynowo pozwala na uzyskanie co najmniej 10 µg znakowanego cDNA.

Stopień wbudowania barwnika można obliczyć, korzystając z prostego stosunku barwnika bazowego, w którym stosunek nukleotydów do SI 3 jest równy stosunkowi A 2 60 do A 5 50 pomnożonemu przez 23,15. Prawidłowa reakcja powinna dać wartość od 50 do 80. Akceptowalna hybrydyzacja będzie charakteryzować się nasyceniem od 1 do 2% cech.

Wartość 1E-5 znormalizowanych zliczeń przy granicy nasycenia wynoszącej 65 000. Po ustawieniu wartości PMT w pobliżu 500, jakość hybrydyzacji można również ocenić jakościowo, przeglądając zeskanowany obraz mikromacierzy i oceniając intensywność wyrównanych oligosów w stosunku do innych elementów macierzy. Zeskanowany obraz należy również ocenić pod kątem występowania szczególnych plam lub pyłków w obszarze macierzy.

W późniejszej analizie można wykorzystać wykres rozrzutu do obrazowania analizowanych danych w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach oraz zidentyfikowania genów wykazujących ekspresję różnicową. Geny o ekspresji różnicowej będą znacząco odbiegać od linii dopasowania. W uzupełniającej procedurze pokazaliśmy, jak wyizolować RNA z embrionów zebrafish i zsyntetyzować cDNA. Tutaj zaprezentowaliśmy sposób znakowania i hybrydyzacji cDNA na platformie mikroarray oligonukleotydowej w celu badania globalnych profili ekspresji genów.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze pamiętać o zastosowaniu wysokiej jakości CD NA oraz unikaniu wystawiania barwnika site three na bezpośrednie działanie światła. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.