Mozaikowa transgeneza u danio pręgowanego do oceny sekwencji enhancerów

Cześć, jestem Erica Kgi z laboratorium Shannon Fisher w Katedrze Biologii Komórki i Rozwojowej na Uniwersytecie Pensylwanii. Jestem Chris Weber, również z laboratorium Fisher. A ja jestem Shannon Fisher.

Dzisiaj przedstawimy procedurę analizy funkcji elementów enhancerowych z wykorzystaniem transgenezy u rybek zebrafish. Stosujemy tę procedurę do badania regulacji transkrypcyjnej genów istotnych dla rozwoju szkieletu. Zacznijmy zatem.

Aby zidentyfikować sekwencje niekodujące otaczające geny kandydackie, wykorzystujemy algorytm fast cons, który jest dostępny jako ścieżka (track) w przeglądarce genomu uc SC. Interesują nas przede wszystkim geny ulegające ekspresji podczas rozwoju szkieletu, jednak to samo podejście można zastosować do badania dowolnych genów wykazujących ekspresję we wczesnym rozwoju. W przedstawionym tutaj przykładzie zidentyfikowaliśmy sekwencje konserwatywne.

W przedziale otaczającym ludzki gen bumper analizujemy cały odcinek aż do genów sąsiednich i wyznaczamy niski próg wartości log score dla danej wielkości, odpowiadający w przybliżeniu górnym 5% sekwencji niekodujących. Po wybraniu sekwencji projektujemy primery za pomocą programu Primer3 w celu amplifikacji każdej sekwencji z ludzkiego genomowego DNA; primery powinny być dobrane tak, aby amplifikować region konserwatywny oraz dodatkowo 30 lub więcej par zasad z każdej strony. Amplifikujemy interesujący nas region przy użyciu wysokiej jakości polimerazy oraz ludzkiego genomowego DNA, a następnie stosujemy standardowe laboratoryjne procedury biologii molekularnej, aby sklonować amplifikowany produkt do wektora ekspresyjnego.

Wektor użyty w niniejszym protokole to PG wc FOS GFPA gateway. Wektor docelowy. Po utworzeniu wektora należy przeprowadzić transpozycję.

Enzym wymagany do transpozycji jest najpierw transkrybowany in vitro przy użyciu zestawu M message M machine firmy Ambion oraz plazmidu PGB 600 przed wstrzyknięciami eksperymentalnymi. Należy przetestować każdą partię transpozaz pod kątem skuteczności, wstrzykując znany wzmacniacz, taki jak mysi Sox10.

W celu przygotowania do iniekcji, wyciągnij igły używane do mikroiniekcji z kapilar szklanych o średnicy 1,2 mm za pomocą wyciągacza mikropipet Sutter P 97. Zastosuj program, który pozwoli uzyskać wytrzymałą końcówkę o ostrym zwężeniu, aby móc przebić nienaruszone choriony za pomocą czystej żyletki i szkiełka mikrometrycznego. Odłam końcówki ręcznie pod mikroskopem stereoskopowym, aż do uzyskania średnicy zewnętrznej wynoszącej około 15 µm.

Igły można przechowywać przez jeden dzień w przykrytym naczyniu do przechowywania. Populację danio pręgowanych należy utrzymywać w regularnym cyklu światło-ciemność z 14 godzinami światła w standardowych warunkach w dniu poprzedzającym wykonanie mikroiniekcji. Ryby należy przygotować do zaplanowanych tarł w małych zbiornikach hodowlanych.

W poranku dnia mikroiniekcji, krótko po rozpoczęciu cyklu świetlnego, umieść trzy samice lub dwa samce w każdym zbiorniku, ustawiając je w równoległych rzędach. Połącz samce i samice w czystej wodzie systemowej w celu uzyskania ikry. Często sprawdzaj stan ryb i zbieraj ikrę w ciągu kilku minut od jej złożenia, aby uzyskać dobrze zsynchronizowane partie.

Podtrzymać produkcję ikry przez dwie do trzech godzin, kontynuując łączenie świeżych grup ryb w ciągu poranka za pomocą szklanej pipety Pastera o szerokim wylocie (5,25 cala) wyposażonej w lateksową gruszkę. Posegregować zebrane embriony do naczyń Petriego o wymiarach 60 x 15 mm, częściowo wypełnionych medium dla embrionów, w grupach po 50 embrionów. Zapisać godzinę zbioru na pokrywce każdego naczynia.

Dla każdej zebranej partii embrionów należy zachować płytkę z 50 embrionami jako nieinjektowaną kontrolę pomiędzy kolejnymi zbiorami jaj. Przygotuj świeże roztwory do iniekcji, mieszając następujące składniki w probówce do mikrocentryfugi, i przechowuj je w lodzie. Umieść igły do iniekcji w płytkach uchwytowych i napełnij je od 1,5 do 2 µL roztworu do iniekcji.

Należy nanieść pipetą krople o objętości 500 nanoliter na szeroki koniec każdej igły. Ciecz zostanie wciągnięta do czubka dzięki działaniu kapilarnemu. Dla każdego roztworu do iniekcji należy przygotować co najmniej dwie igły.

Załaduj wypełnioną igłę do ręcznego uchwytu na igły pneumatycznej pompki piko lub podobnego wtryskiwacza ciśnieniowego, skonfigurowanego i podłączonego do butli z azotem zgodnie z instrukcjami producenta. Skalibruj objętości wtrysku, mierząc średnicę kropel wydalanych do oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym, przyjmując zazwyczaj czas wtrysku wynoszący 120 milliseconds.

Przy ciśnieniu 20 PS uzyskam kroplę o objętości około jednego nanolitra, korzystając ze stereomikroskopu przy powiększeniu od 6 do 10 x. Przytrzymaj embrion za pomocą precyzyjnej pincety i pchnij igłę do iniekcji ze stałym naciskiem przez chorion do żółtka embrionu w stadium jednej komórki lub wczesnego stadium dwóch komórek, umieść końcówkę igły w żółtku tuż poniżej blastomerów, wprowadź około jednego nanolitra roztworu do iniekcji i wycofaj igłę. Dla każdego konstruktu przeprowadzamy iniekcje w ≥ 200 embrionach. Po zakończeniu iniekcji posegreguj embriony, usuwając niezapłodnione jaja, embriony uszkodzone, nieudane iniekcje lub embriony bez czerwieni fenolowej w blastomerach.

Następnie inkubujemy embriony oraz pożywkę dla embrionów w temperaturze 28.5 °C aż do odpowiedniego czasu obserwacji. Teraz zaprezentujemy reprezentatywne wyniki dla elementów wzmacniających, które generują tkankowo specyficzne wzorce ekspresji GFP w embrionie danio pręgowanego. Badamy geny wykazujące ekspresję w kościach lub chrząstkach podczas.

Oto przykład elementu wzmacniającego (enhancera) położonego powyżej genu acan, który reguluje ekspresję w chrząstce czaszkowo-twarzowej w trzeciej dobie po zapłodnieniu. Tutaj znajduje się inny wzmacniacz, tym razem z genu bumper, który reguluje ekspresję w komórkach kostnych. W piątej dobie, spośród wielu zidentyfikowanych przez nas wzmacniaczy, stwierdzamy niewielką korelację między lokalizacją względem genu a regulacją ekspresji.

Przy wyborze sekwencji do przetestowania należy pamiętać, że enhancer może znajdować się setki kilobaz powyżej lub poniżej genu lub w jednym z intronów, co widać w tym embrionie. Znaczna część sekwencji nie wydaje się regulować ekspresji specyficznej dla tkanek. Często wykazują one bardzo słabą fluorescencję lub mogą posiadać kilka rozproszonych komórek w dwóch powszechnych miejscach ekspresji ektopowej: w naskórku i mięśniach szkieletowych.

Właśnie pokazaliśmy, jak identyfikować potencjalne elementy enhansera poprzez konserwację sekwencji i testować ich funkcję za pomocą transgenezy mozaikowej u danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest sprawdzenie jakości DNA i RNA przeznaczonych do iniekcji. Należy również dokładnie zbadać wszystkie zainiekowane embriony, zwłaszcza jeśli oczekuje się ekspresji tylko w niewielkiej grupie komórek.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.