Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Aby przeprowadzić rekonstrukcje rozwijających się organów u Drosophila melanogaster, musimy określić model przedni, który najlepiej opisuje propagację światła wewnątrz poczwarki. Procedurę rozpoczyna się od wyboru białej przepoczwarki i przyklejenia jej do końca rurki kapilarnej w taki sposób, aby oś przednio-tylna poczwarki była zorientowana równolegle do rurki. Małą rurkę kapilarną wypełnia się barwnikiem fluorescencyjnym i wprowadza do osłonki poczwarki.

Po dokładnym ustawieniu osi, poczwarka zostaje obrócona o 360 stopni. Obrazy są pozyskiwane pod różnymi kątami. Uzyskane dane z fluorescencyjnego oświetlenia przechodzącego są wykorzystywane do określenia modelu bezpośredniego, który zostanie zastosowany do obrazowania rozwoju narządów.

Witajcie, nazywam się Claudia i pracuję w Centrum Biologii Wspomagającej (Center for Assistance Biology) w Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Jestem Ula Petou z laboratorium Paramount w Harvard Medical School, a ja jestem Daniel Rozanski z Instytutu Obrazowania Biologicznego i Medycznego na Uniwersytecie Technicznym w Monachium oraz w Centrum Heliman w Monachium. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę trójwymiarowej rekonstrukcji całego ciała w modelu Oph Melano Casta.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do wizualizacji in vivo rozwijających się narządów podczas stanu źrenic. Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem prosimy zauważyć, że nie ma towarzyszącego filmu, który należałoby obejrzeć przed tym materiałem, w którym niektóre aspekty techniczne optycznej tomografii projekcyjnej są wyjaśnione bardziej szczegółowo niż tutaj.

Ponadto, inny film wyjaśnia obrazowanie przygotowanych tkanek lub organów większych zwierząt. we wszystkich eksperymentach opisanych w tym filmie zostaną użyte transgeny drosophila. Są to EL A gal four wykazujący ekspresję w gruczołach ślinowych, apteris gal four, który wykazuje ekspresję w tkankach prekursorowych larwalnych skrzydła i klatki piersiowej dorosłego owada, oraz transgen kodujący białko fluorescencyjne.

W odpowiedzi na gal four zwany U-A-S-G-F-P oraz white 1118, niefluorescencyjne samce kontrolne niosące transgeny UAS są krzyżowane z dziewiczymi samicami niosącymi transgeny GAL four w celu uzyskania tkankowo specyficznej ekspresji GFP. Krzyżówki są zakładane z ośmiu do 10 dziewiczych samic i samców na standardowej pożywce dla muszek z dodatkiem drożdży piekarskich. Fiolki są przechowywane w temperaturze 25 °C w inkubatorze z nawilżaczem, w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność.

Dwa dni po rozpoczęciu krzyżowania rodzice są przenoszeni do nowej fiolki, a pięć do sześciu dni później PUI zaczną zasiedlać fiolkę w stadium PrepU. Są one wybierane pod kątem ekspresji GFP przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Selekcja białych osobników PrepU PUI zapewnia prawidłowe określenie stadium rozwojowego zwierząt, ponieważ pozostają one białe przez około jedną godzinę.

Po procesie pupilacji stają się one pigmentowane lub brązowawe. Pupile wykazujące ekspresję GFP są delikatnie zbierani z fiolek za pomocą wilgotnego pędzla i przenoszeni do kropli wody lub PBS w szalce Petriego, przy czym pędzel musi zostać dokładnie oczyszczony z materiałów autofluorescencyjnych. Po użyciu pędzla są one gotowe do obrazowania tomograficznego.

Jeśli PrepU wymaga dalszego dojrzewania, aby osiągnąć odpowiedni stopień rozwoju, można je pozostawić w szalce Petri z wilgotnym ręcznikiem papierowym lub w czystej fiolce do żywności. Zapewni to wystarczającą wilgotność i prawidłowy rozwój niezbędny do obrazowania. PrepU musi zostać przytwierdzone do wnętrza szklanej kapilary o średnicy 800 µm.

Nanieś superglue na tylny koniec poczwarki, a następnie umieść przyklejoną powierzchnię przedpoczwarki w rurce w taki sposób, aby oś przednio-tylna muchy była równoległa do rurki. Przednia część zwierzęcia będzie wystawać poza rurkę kapilarną. Rurka kapilarna zostaje teraz zamocowana na stole obrotowym mikroskopu.

W pozycji pionowej wyreguluj oś nachylenia stopnia obrotowego tak, aby oś obrotu probówki była równoległa do kolumn pikseli obrazującej kamery CCD. Po precyzyjnym ustawieniu pozycji muchy przystąp do obrazowania. W tym przykładzie obrazowane są zwierzęta z fluorescencyjnymi gruczołami ślinowymi; muchy wykazujące ekspresję GFP w gruczołach ślinowych można uzyskać poprzez krzyżowanie linii EAG four i U-A-S-G-F-P.

Zaczynamy od zamocowanej przedpoczwarki, którą oświetlamy wiązką wzbudzenia, a następnie rejestrujemy sygnał fluorescencji GFP. W trybie transiluminacji obracamy przedpoczwarkę o 360 stopni wokół jej osi pionowej i pozyskujemy obrazy w transiluminacji. Każdy obraz odpowiada obrotowi o 10 stopni.

Całkowity czas akwizycji zależy od ilości fluorescencji oraz intensywności wiązki wzbudzenia. Typowe czasy wynoszą około jednej minuty. W tym przykładzie obrazowane będą poczwarki DSO wykazujące ekspresję GFP w tarczach imaginalnych skrzydeł.

Poczwarkę tę można pobrać z fiolki zawierającej potomstwo skrzyżowania linii Aus GAL four i U-A-S-G-F-P. Przedpoczwarkę montuje się zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Ponieważ jednak czas obrazowania w tym eksperymencie wynosi około ośmiu godzin, kluczowe jest, aby środowisko pozostało wilgotne i w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć odwodnienia i śmierci zwierzęcia, nad wiązką wzbudzenia umieszcza się migawkę, co zapobiega wygaszaniu fluoroforów w badanej tkance, a także zapewnia, że zwierzę nie zostanie przypalone wiązką lasera; następnie, podobnie jak wcześniej, oświetla się próbkę wiązką wzbudzenia i rejestruje sygnał fluorescencji GFP za pomocą oświetlenia przechodzącego.

Przedpoczwarka jest całkowicie obracana wokół swojej osi pionowej. Podczas gromadzenia danych rotacja trwa tylko jedną minutę i jest powtarzana w różnych odstępach czasu. Aby stworzyć serię obrazów typu time-lapse przedstawiającą skrzydła podczas rozwoju, dane można pozyskiwać przez co najmniej sześć godzin w tempie 100 obrazów na godzinę.

Kluczowe jest kontrolowanie całkowitej ekspozycji na światło za pomocą tej migawki, aby zapobiec uszkodzeniom lub fotoblaknięciu. Film przedstawia obrazy pozyskane pomiędzy etapem PrepU a odruchem odsuwania głowy (pupil head aversion). Podczas rekonstrukcji obrazu trójwymiarowego występuje silne rozpraszanie w przód, które należy uwzględnić i którego nie można przybliżyć za pomocą dyfuzji.

Aby wykonać rekonstrukcję, należy wyznaczyć model rozpraszania w przód dla propagacji światła. Dla uproszczenia pomijamy absorpcję. Ilość rozpraszania jest testowana eksperymentalnie. W tym celu do niefluorescencyjnej, białej przepoczwarki 1118 wprowadza się ciało obce o zestandaryzowanej fluorescencji, a następnie przeprowadza skanowanie w celu wygenerowania danych do modelu w przód. Pracę rozpoczynamy od napełnienia kapilary kwarcowej o średnicy 100 micron barwnikiem fluorescencyjnym PS 5.5.

Wykorzystując działanie kapilarne, wprowadź rurkę kapilarną do poczwarki pod kątem 45 stopni względem osi przedniej, zamocuj PrepU w rurce kapilarnej i odpowiednio ustaw na obrotowym stole, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie oświetl przepoczwarkę wiązką lasera wzbudzającego przy użyciu soczewki o niskiej aperturze numerycznej i zbierz obrazy fluorescencyjne w oświetleniu przechodzącym. Jak opisano wcześniej, oprogramowanie MATLAB jest wykorzystywane do dopasowania danych do jawnego teoretycznego modelu przedniego. Aby ułatwić proces rekonstrukcji, wybrano przybliżenie dyfuzyjne równania transportu, ponieważ opisuje ono reżim rozpraszania przedniego i jest zgodne z danymi eksperymentalnymi.

Po wyznaczeniu odpowiedniego modelu przedniego możemy zrekonstruować gruczoły ślinowe i uzyskać tomograficzne rekonstrukcje w odstępach czasu. Jeśli planujesz zastosować tomografię w wolnej przestrzeni, można również skonfigurować algorytmy dopasowania współczynnika załamania światła. Najpierw przedstawiamy rekonstrukcję 3D gruczołów ślinowych we wczesnej fazie rozwoju.

Dla porównania, barwienie histologiczne gruczołów ślinowych wykazuje, że rekonstrukcje dobrze korelują z obrazem histologicznym. Ten film poklatkowy rozwoju tarczek imaginalnych skrzydła został zarejestrowany z jednego żywego osobnika. Dla porównania barwienie histologiczne tarczki skrzydła w tych samych punktach czasowych wykazuje, że rekonstrukcje dobrze korelują z obrazem histologicznym.

Właśnie pokazaliśmy, jak zbudować system do obrazowania struktur trójwymiarowych in vivo w organizmie muchy, w czasie. Pozwala to na śledzenie morfogenezy u Drosophila oraz monitorowanie rozwoju skrzydeł przez sześć kolejnych godzin. Podczas wykonywania tej procedury kluczowe jest wybranie odpowiedniego modelu w przód dla propagacji światła wewnątrz Drosophila.

Metodę tę można stosować w połączeniu z technikami histologicznymi, aby wyjaśnić mechanizmy rozwoju organów podczas etapów rozwoju źrenicy u ryb, a także można ją modyfikować w celu badania innych organizmów o podobnej wielkości. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.