Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

W tej technice szklane krateczki przykrywki są funkcjonalizowane mieszaniną obojętnych cząsteczek PEG oraz cząsteczek PEG z biotyną. Z tej funkcjonalizowanej powierzchni tworzy się komorę przepływową, która zostaje umieszczona na mikroskopie TIRF. Biotynilowane matryce do amplifikacji metodą kroczącego kręgu są przytwierdzane do powierzchni przy użyciu wielowartościowej streptawidyny.

Kiedy substraty są replikowane poprzez dodanie białek strefy replikacji i nukleotydów, powstały dwuniciowy DNA jest wydłużany za pomocą przepływu laminarnego i obrazowany w czasie rzeczywistym przy użyciu barwnika interpolującego. Cześć, jestem Nathan Tanner z laboratorium Antoine'a Van Dykna w Katedrze Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej w Harvard Medical School. Jestem Joe Laro, również z laboratorium Van Dykna.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania fluorescencyjnego replikacji DNA w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych cząsteczek. Wykorzystujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania skoordynowanej aktywności syntezy DNA poszczególnych kompleksów replikacyjnych. Zapraszamy do oglądania.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić hybrydyzację biotynilowanego oligonukleotydu ogonowego z jednoniciowym DNA M 13, dodając dziesioprotokną nadmiar oligonukleotydu w buforze TBS i podgrzewając do 65 °C, a następnie wyłączając blok grzejny, aby umożliwić powolne chłodzenie w celu prawidłowej hybrydyzacji primera. Po przygotowaniu primera M 13, należy dodać go do mieszaniny 64 nM polimerazy DNA T7 oraz buforu do replikacji T7 zawierającego dNDP i chlorek magnezu, a następnie inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 12 minut. Po zakończeniu inkubacji reakcję należy przerwać, dodając 100 mM EDTA.

Następnie oczyść uzyskany produkt DNA za pomocą ekstrakcji fenolo-chloroformowo-izoamylalkoholowej i poddaj dializie do buforu TE lub innego odpowiedniego buforu do przechowywania, ponownie ekstrahując każdą fazę organiczną w celu odzyskania wszelkich pozostałości primera M 13. Po dializie określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV-vis. Jedna iteracja przygotowania matrycy pozwala uzyskać nanomolowe stężenie matrycy wystarczające do przeprowadzenia od setek do tysięcy eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami.

Po przygotowaniu DNA należy przystąpić do przygotowania funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych. DNA przeznaczone do replikacji jest przytwierdzone do szkiełek nakrywkowych zfunkcjonalizowanych aminolanem; grupa tlenkowa aminolanu wiąże się ze szkłem, pozostawiając grupę aminową dostępną do wiązania biotynylowanych cząsteczek PEG. Powłoka ta pomaga zredukować niespecyficzne wiązanie z powierzchnią.

Aby dokładnie oczyścić szkiełka nakładkowe, należy umieścić je w naczyniach do barwienia i napełnić je etanolem, a następnie poddać sonikacji. Po 30 minutach naczynia należy wypłukać i napełnić jednomolowym wodorotlenkiem potasu. Następnie należy sonikować przez 30 minut i powtórzyć oba etapy mycia. Przed pierwszą reakcją funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody.

Napełnić naczynia do barwienia acetonem i poddać działaniu ultradźwięków przez 10 minut. Opróżnić naczynia i ponownie napełnić je acetonem. Następnie dodać do naczyń odczyn sine i mieszać przez dwie minuty.

Następnie przeprowadzić hartowanie, dodając duży nadmiar wody. Potem osuszyć szkiełkach nakrywkowych, wygrzewając je w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 minut. Następnie przygotować mieszaninę PEG o stężeniu około 0,2% masy na objętość; użycie szklanego dystansera pozwoli na oddzielenie szkiełek nakrywkowych. Nanieść pipetą 100 µL na suche, sylinizowane szkiełko nakrywkowe.

Na wierzchu umieść drugie szkiełko cover slip. Inkubuj szkiełka w roztworze PEG przez trzy godziny. Następnie rozdziel każdą parę szkiełek i dokładnie przemyj je wodą.

Należy pamiętać, aby trzymać szkiełka nakrywki stroną funkcjonalizowaną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta peg. Na koniec należy osuszyć szkiełka nakrywki sprężonym powietrzem i przechowywać je w próżni w eksykatorze; powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc. Dzięki temu można przygotować kilkadziesiąt szkiełek nakrywek w jednej partii i wykorzystywać je w miarę potrzeb.

Po przygotowaniu szkiełek podstawowych można złożyć komorę przepływową do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami. Należy rozpocząć od przelania 20 do 25 ml buforu blokującego zawierającego BSA do desykatora, aby usunąć pęcherzyki powietrza niezbędne w kolejnych krokach. Następnie należy rozcieńczyć 25 µl streptawidyny w 100 µl PBS i rozprowadzić roztwór na powierzchni funkcjonalizowanego PEG szkiełka podstawowego; inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić związanie streptawidyny z biotyną powierzchniową, przygotowując w tym czasie pozostałe elementy komory.

Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego utnij kawałek dwustronnej taśmy z podkładką po obu stronach, tak aby odpowiadał on rozmiarowi płytki kwarcowej użytej do montażu komory przepływowej. Ołówkiem zaznacz na taśmie położenie otworów na rurki, aby narysować na niej zarys komory przepływowej. Po zaznaczeniu otworów narysuj wokół nich prostokąt o szerokości dwóch milimetrów.

Ten prostokąt będzie pełnił funkcję kanału przepływowego, dlatego należy zadbać o proste krawędzie i pozostawić miejsce wokół wlotu oraz wylotu rurki. Teraz przetnij zaznaczoną taśmę wzdłuż narysowanego obrysu, wykonując proste i czyste cięcia, aby mieć pewność, że żaden klej nie wystaje do wnętrza kanału. Dokładnie oczyść szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć pozostałości kleju z konstrukcji komory przepływowej użytej w poprzednich doświadczeniach.

Znajdź optymalne dopasowanie obrysu kanału. Zdejmij pasek zabezpieczający z jednej strony warstwy klejącej i ostrożnie przyłóż taśmę do szkiełka przedmiotowego. Pamiętaj o prawidłowym wyrównaniu taśmy, aby otwory wlotowe i wylotowe pozostały niezablokowane.

Następnie przygotuj odpowiednie odcinki rurek o średnicy 0,76 milimetra dla wlotu i wylotu celi przepływowej. Zaleca się przycięcie końców rurek pod kątem około 30 stopni, aby zapobiec ich całkowitemu przyleganiu do dna komory. Zawieś rurki na statywach do probówek, co ułatwi ich podłączenie do celi przepływowej w kolejnych krokach.

W tym momencie inkubacja szkiełka nakrywki dobiegła końca. Dokładnie wypłucz pokrytą przeciwciałem strep avid ENC nakrywkę wodą i osusz ją sprężonym powietrzem. Należy uważać, aby nie odwrócić nakrywki, ponieważ funkcjonalizowana jest tylko jedna jej strona.

Na koniec zakończ montaż komory przepływowej, usuwając zabezpieczenie z drugiej strony taśmy i kładąc płytkę kwarcową na szkiełku nakrywce. Delikatnie naciśnij szkiełko nakrywce, aby usunąć uwięzione w kleju powietrze. Pomoże to zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.

Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Wprowadź przecięte rurki do otworów w kwarcu, uszczelnij je żywicą epoksydową i pozostaw do wyschnięcia na kilka minut. Po wyschnięciu uszczelnienia z żywicy rozpocznij blokowanie powierzchni.

Używając igły o rozmiarze 21 G, przepuść niewielką ilość buforu blokującego Degas przez jedną z rurek. Przepłucz układ kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie pozostaw komorę do inkubacji przez co najmniej pół godziny przed przejściem do eksperymentu replikacji pojedynczych cząsteczek.

Po zablokowaniu komory przepływowej należy umieścić ją na stoliku mikroskopu. Przymocować komorę za pomocą uchwytów stolika, upewniając się, że kanał przepływowy jest wyrównany wzdłuż osi y. Połączyć rurkę wylotową komory przepływowej z pompą strzykawkową, używając łącznika o większej średnicy.

Umieść wlot w buforze blokującym i odciągnij tłok strzykawki, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne stuknięcie rurki wylotowej pomoże usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w celi przepływowej. Następnie dodaj DNA; rozcieńcz zapasowy matrycowy DNA do stężenia 25 picomolar w jednym mililitrze buforu blokującego i wprowadź go do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, np. 0,025 mililitrów na minutę przez 30 minut, aby zapewnić odpowiednie pokrycie powierzchni przez DNA.

Gdy DNA znajdzie się w komorze, wypłucz nadmiar DNA, stosując bufor blokujący przez co najmniej 200 objętości ogniwa przepływowego. Aby usunąć całe wolne DNA, włącz laser i kamerę. Chłodzony detektor CCD musi osiągnąć odpowiednią temperaturę przed rozpoczęciem pracy.

Po wypłukaniu nadmiaru DNA i odgazowaniu buforu do replikacji, przygotuj mieszaninę do reakcji replikacji, zawierającą nukleotydy, DTT i cytoksynę w buforze do replikacji. Następnie dodaj białka i delikatnie wymieszaj. Po tym wprowadź mieszaninę reakcyjną do komory przepływowej.

Prędkość przepływu w tym miejscu musi być wystarczająca, aby rozciągnąć dwuniciowy DNA. Dla kanału przepływowego o szerokości 2 mm i wysokości 100 µm odpowiednia wartość to 0,04 ml/min. Należy odczekać około 10 minut, aż mieszanina przedostanie się do komory.

Przesuń pole widzenia na bok kanału i ustaw ostrość na materiale adhezyjnym, aby upewnić się, że obszar ostrzenia znajduje się blisko powierzchni przed rozpoczęciem obrazowania. Dostosuj moc lasera, ostrość mikroskopu oraz kąt nachylenia. Utrzymuj niską moc, aby uniknąć fotolizy barwionego DNA.

Należy przeprowadzać akwizycję w tempie od jednej do pięciu klatek na sekundę przez kilka minut, w zależności od szybkości replikacji DNA. Czynność tę należy powtórzyć, aby uzyskać dłuższe trajektorie replikacji, lub przenieść się do nowego pola widzenia, aby zaobserwować więcej cząsteczek, gdy prawie cała mieszanina reakcyjna zostanie wpompowana do komórki; w celu obejrzenia innych pól widzenia należy dopompować więcej buforu z cyt. Wykonanie wielu obrazów różnych replikowanych cząsteczek pozwala na uzyskanie statystyk niezbędnych do określenia wydajności.

W teście replikacji typu rolling circle synteza prowadząca wydłuża ogon łączący koło z powierzchnią; ogon ten zostaje przekształcony w dwuniciowe DNA przez polimerazę nici opóźnionej i rozciągnięty przez przepływ laminarny. Oto przykład pola widzenia z wykorzystaniem Cy3 orange przy pobudzeniu 532 nanometrami.

Małe fluorescencyjne punkty to przywiązane substraty niepodzielone. Zwróć uwagę na ekstremalną długość produktów oraz ich dużą liczbę w jednym polu widzenia. Typowe pole widzenia wykaże liczne replikujące się cząsteczki, widoczne jako rosnące, jasne linie barwionego DNA. Eksperymenty z E Coli w 37 °C dają od pięciu do 50 cząsteczek na pole, w zależności od gęstości powierzchni.

Strefa replikacji T7 inicjuje proces znacznie wydajniej i zreplikuje ponad 50% cząsteczek w polu widzenia. Przy tak wysokiej gęstości trudno jest rozdzielić poszczególne cząsteczki, co widać tutaj. Należy zatem przeprowadzić eksperyment z T7 przy niższych stężeniach białka lub mniejszej gęstości powierzchniowej. Wykresy Chime dla typowych replikujących się cząsteczek z e coli oraz eksperymentów T7 obejmują trajektorie końcowe cząsteczek z e coli i T7 wykreślone w funkcji czasu. Trajektorie dopasowano za pomocą regresji liniowej w celu uzyskania szybkości replikacji, które w tym przykładzie wynoszą 467,1 pz/s dla e coli oraz 99,4 pz/s dla T7.

W przypadku T7 rozkłady prędkości trajektorii pojedynczych cząsteczek dopasowane do pojedynczych rozkładów Gaussa dają średnią wynoszącą 535,5 ± 39 par zasad na sekundę dla e coli oraz 75,9 ± 4,8 par zasad na sekundę. Dla T7 rozkłady długości produktów replikacji dopasowano do pojedynczego wykładniczego zaniku w celu wyznaczenia produktywności, która wynosi 85,3 ± 6,1 kilopar zasad dla e coli oraz 25,3 ± 1,7 kilopar zasad dla G7. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę pomiaru skoordynowanej replikacji DNA z wykorzystaniem pojedynczych cząsteczek.

Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o prawidłowej funkcjonalizacji szkiełek nakrywkowych i stworzeniu czystych, prostych kanałów przepływu. Należy dbać o utrzymanie niskiej mocy lasera i minimalizację fotolizy długich cząsteczek DNA. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.