Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół wizualizacji replikacji DNA za pomocą szerokopolowej mikroskopii optycznej z wykorzystaniem zlinearyzowanego i chemicznie zmodyfikowanego DNA faga lambda. DNA jest przytwierdzone do funkcjonalizowanego szkiełka podstawowego. Wolny koniec DNA jest znakowany koralikiem, a następnie DNA jest rozciągane poprzez przepływ laminarny.

W momencie inicjacji replikacji nić prowadząca zaczyna się wydłużać, natomiast nić opóźniona skraca się z powodu zwijania. Duża różnica w długości między dwuniciowym a jednoniciowym DNA przy niskich siłach umożliwia bezpośrednią obserwację konwersji DNA podczas replikacji. Długość konstrukcji DNA jest monitorowana poprzez śledzenie pozycji kuleczki, co pozwala na precyzyjne określenie szybkości i przebiegu replikacji DNA.

Witajcie, jestem Ari Ulrich z laboratoriów Anto one Vaniana i Charlesa Richardsona w Katedrze Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej na Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Stosujemy tę procedurę w naszych laboratoriach do badania aktywności enzymatycznych zachodzących podczas syntezy DNA.

Zacznijmy zatem. Na początku tej procedury zlinearyzowane DNA bakteriofaga Lambda jest modyfikowane za pomocą krótkich oligonukleotydów w celu utworzenia widełek replikacyjnych: komplementarnego ramienia widełek lambda, biotynylowanego ramienia widełek oraz startera widełek. Biotynylowane ramię widełek posiada przyłączoną do końca 5' biotynę, która umożliwia przytwierdzenie matrycy DNA do powierzchni komory przepływowej.

DNA lambda jest następnie modyfikowane poprzez hybrydyzację z kolejnym oligonukleotydem zawierającym resztę digenylu, która służy jako immunoznak o wysokim powinowactwie do przytwierdzenia koralika. Aby utworzyć widełki replikacyjne, należy pozyskać DNA lambda oraz kilka oligonukleotydów, których sekwencje znajdują się w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Oligonukleotydy te obejmują biotynilowane ramię widełek, komplementarne ramię widełek lambda, starter widełek oraz komplementarny koniec digenylu lambda; następnie należy przeprowadzić fosforylację końców 5' komplementarnego ramienia widełek lambda oraz komplementarnego końca digenylu lambda za pomocą kinazy polinukleotydowej T4.

Następnie wymieszaj fosforylowane lambda komplementarne ramię widelca, biotynilowane ramię widelca, primer widelca oraz DNA lambda w stosunku molowym 10:10:100:1. W buforze T4 DNA Ligase podgrzej mieszaninę w temperaturze 65 °C przez pięć minut, a następnie powoli schłodź do temperatury pokojowej, wyłączając blok grzejny, aby umożliwić prawidłowe hybrydyzowanie oligonukleotydów oraz dodaj T4 DNA ligase do mieszaniny i inkubuj przez dwie godziny. W temperaturze pokojowej T4 DNA Ligase skatalizuje uszczelnienie nacięć między oligonukleotydami a lambda.

Ostatecznie przyłączono sfosforylowany koniec komplementarny do digoksigeniny lambda do matrycy replikacji DNA, dodając sfosforylowany koniec komplementarny do digoksigeniny lambda w buforze do ligazy T4; mieszaninę inkubowano przez 30 minut w temperaturze 45 °C, a następnie powoli schłodzono do temperatury pokojowej poprzez wyłączenie bloku grzejnego. Następnie przeprowadzono ligację sfosforylowanego końca komplementarnego do digoksigeniny lambda z matrycą replikacji DNA poprzez dodanie ligazy DNA T4 do mieszaniny i inkubację przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Końcowa matryca replikacji DNA jest teraz gotowa do użycia. Aby przyłączyć aktywowane magnetycznie kulki do matrycy replikacji DNA, muszą one zostać funkcjonalizowane fragmentem FAB specyficznym dla digoksigeniny.

Aby rozpocząć ten proces, resuspendować roztwór stokowy kulek i przenieść 400 µL do probówki typu Eppendorf. Umieścić probówkę w separatorze magnetycznym i inkubować do momentu, aż roztwór stanie się przejrzysty. Następnie usunąć nadsącz za pomocą pipety. Aby aktywować grupy tiolowe w celu sprzężenia przeciwciał, dodać 1 mL buforu wiążącego i delikatnie wymieszać metodą pipetowania.

Ponownie usuń nadsącz za pomocą separatora magnetycznego. Następnie dodaj 240 µL fragmentu FAB i resuspenduj kuleczki w 400 µL buforu boranowego. Wymieszaj dokładnie i inkubuj na rotatorze przez 16 do 24 godzin w temperaturze 37 °C.

Po inkubacji oddzielć kuleczki za pomocą separatora magnetycznego i usuń nadsącz. Przemyj kuleczki jednym mililitrem buforu piorącego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie usuń bufor za pomocą separatora magnetycznego. Czynność płukania powtórz dwukrotnie.

Aby zablokować wolne grupy tosylowe, należy dodać jeden mililitr BSA w buforze Tris i inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji należy usunąć bufor z kulek za pomocą separatora magnetycznego, przepłukać dwukrotnie buforem i rozdzielić na porcje. Do przeprowadzenia procesu DNA podlegające replikacji jest przytwierdzone do szkiełek podstawkowych funkcjonalizowanych Amil lane.

Grupa oksy Amil lane wiąże się ze szkłem, pozostawiając grupę aminową dostępną do wiązania z biotynilowanymi cząsteczkami peg. Powłoka ta pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie z powierzchnią. Aby dokładnie oczyścić szkiełka podstawowe, należy umieścić je w naczyniach do barwienia, wypełnić naczynia etanolem i poddać sonikacji.

Przez 30 minut płukać słoiki, a następnie napełnić je roztworem wodorotlenku potasu o stężeniu 1 M i poddać sonikacji przez 30 minut; powtórzyć oba etapy płukania. Przed pierwszą reakcją funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody. Napełnić słoiki do barwienia acetonem i sonikować przez 10 minut.

Opróżnij słoiki i ponownie napełnij je acetonem. Następnie dodaj do słoików odczynnik sine i mieszaj przez dwie minuty. Po tym czasie przerwij reakcję, dodając dużą nadwyżkę wody.

Następnie wysusz szkiełka nakrywkowe, wypalając je w piecu w temperaturze 110 °C przez 30 minut. W następnym kroku przygotuj mieszaninę PEG o stężeniu około 0,2% w/v. Biotynilowany PEG, wraz z dystanserem ze szkiełka nakrywkowego, umożliwi rozdzielenie szkiełek; nanieś pipetą 100 µL roztworu na suche, sylonizowane szkiełko nakrywkowe.

Na wierzchu umieść drugą lamellkę. Inkubuj lamellki w roztworze PEG przez trzy godziny. Następnie rozdziel każdą parę lamellek i dokładnie wypłucz je wodą.

Należy pamiętać, aby trzymać szkiełka nakrywkowe stroną funkcjonalizowaną do góry, ponieważ powłoka z peg zostanie naniesiona tylko na jedną stronę. Na koniec należy osuszyć szkiełka nakrywkowe sprężonym powietrzem i przechowywać je w próżni w eksyكاتهm. Powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc, co pozwala na przygotowanie kilkudziesięciu szkiełek nakrywkowych w jednej partii i wykorzystywanie ich w miarę potrzeb.

Po przygotowaniu szkiełek zakrywek można przystąpić do montażu komory przepływowej do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami. Eksperyment z pojedynczymi cząsteczkami przeprowadza się przy użyciu prostej komory przepływowej skonstruowanej z funkcjonalizowanej szkiełka zakrywkowej, dwustronnej taśmy klejącej, szkiełka kwarcowego i rurek.

Zacznij od zmieszania 5 ml buforu blokującego i 20 ml buforu roboczego, a następnie umieść mieszaninę w desykatorze w celu usunięcia pęcherzyków powietrza przed kolejnymi etapami. Następnie nanieś 100 µl roztworu roboczego strp din w PBS na powierzchnię funkcjonalizowanej szkiełka nakrywkowego (Cover slip) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić związanie strp din z biotyną na powierzchni. W międzyczasie odetnij kawałek dwustronnej taśmy o rozmiarze odpowiadającym szkiełku kwarcowemu i zaznacz na taśmie położenie otworów na rurki.

Wykreśl obrys komory przepływowej, rysując środkowy kanał o szerokości 3 mm oraz prostokąty obejmujące oba otwory. Komory przepływowe mogą być zaprojektowane z dwoma wlotowymi i dwoma wylotowymi kanałami w kształcie litery Y. Następnie wytnij zaznaczoną taśmę wzdłuż narysowanego obrysu, wykonując proste i precyzyjne cięcia, aby mieć pewność, że żadna część kleju nie wystaje do wnętrza kanału.

Dokładnie oczyść szkiełko kwarcowe za pomocą acetonu, aby usunąć klej z konstrukcji celi przepływowej użytej w poprzednich eksperymentach. Znajdź optymalne dopasowanie obrysu kanału. Odklej jedną stronę warstwy klejącej i ostrożnie nanieś taśmę na szkiełko kwarcowe.

Należy zadbać o prawidłowe wyrównanie taśmy, aby otwory wlotowy i wylotowy pozostały niezatkane. Następnie należy przygotować odpowiednie długości odcinków rurek o średnicy wewnętrznej 0,76 mm do wlotu i wylotu celi przepływowej. Końcówkę rurki należy odciąć pod kątem około 30 stopni, aby rurka nie przylegała płasko do dna komory.

Zawieś rurki na statywach do probówek, aby ułatwić ich późniejsze podłączenie do celi przepływowej w kolejnych krokach. W tym czasie inkubacja szkiełka podstawowego powinna być już zakończona. Dokładnie opłucz szkiełko wodą i osusz je za pomocą sprężonego powietrza.

Należy uważać, aby nie odwrócić szkiełka nakrywkowe, ponieważ tylko jedna jego strona jest funkcjonalizowana peg. Zakończ montaż komory przepływowej, zdejmując zabezpieczenie z drugiej strony taśmy i kładąc płytkę kwarcową na szkiełku nakrywkowe. Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć uwięzione w kleju powietrze. Pomoże to zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.

Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Wsuń odcięte rurki w otwory w kwarcu i utrwal je w miejscu za pomocą żywicy epoksydowej. Pozostaw do wyschnięcia na kilka minut.

Po wyschnięciu należy użyć igły o rozmiarze 21 G, aby przepchnąć część buforu blokującego DGA przez jedną z rurek w celu zablokowania powierzchni komory. Należy kilkakrotnie przepłukać układ, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie inkubować komorę przez co najmniej 30 minut przed przystąpieniem do eksperymentu replikacji pojedynczych cząsteczek. Po przygotowaniu funkcjonalizowanych koralików z matrycą DNA oraz komory przepływowej można przeprowadzić eksperyment z pojedynczymi cząsteczkami.

Na początek należy umieścić celę przepływową na stoliku mikroskopu. Komorę należy unieruchomić za pomocą uchwytów stolika, upewniając się, że kanał przepływowy jest wyrównany z kamerą CCD. Następnie należy podłączyć wcześniej przygotowany układ sprężyny powietrznej do pompy strzykawkowej oraz do rurek wylotowych celi przepływowej.

Używając przewodów łączących o większej średnicy, należy umieścić rurki wlotowe celi przepływowej w buforze blokującym i odciągnąć tłok strzykawki, aby usunąć pęcherzyki powietrza z przewodów, a następnie delikatnie potrząsnąć rurkami wylotowymi, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w celi przepływowej. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza jedną z rurek wlotowych należy zablokować igłą, a jedną z rurek wylotowych zamknąć, zginając ją o 180 stopni i mocując taśmą klejącą. Przed wprowadzeniem DNA do celi należy rozcieńczyć zapasowy matrycowy DNA do stężenia 10 picomolar w jednym mililitrze buforu blokującego DGAs 1x. Matrycę należy wprowadzić do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, aby zapewnić dobre pokrycie powierzchni przez DNA.

Rozcieńczyć roztwór zapasowy kulek do stężenia od dwóch do czterech razy 10⁶ kulek na mililitr w 1 ml 1x buforu blokującego DGAs. Następnie wymieszać mieszaninę w wirówce typu vortex i poddać sonikacji przez 20 sekund.

Przenieś rozcieńczony roztwór kulek do komory. Po dodaniu kulek wyłącz przepływ i poczekaj, aż w komorze osiągnięta zostanie równowaga. Następnie zamknij obie rurki wylotowe.

Wszelkie zmiany w rurkach przy otwartej komorze spowodują wahania ciśnienia, które wywrą silną siłę na kuleczki i doprowadzą do ścięcia przywiązanych cząsteczek DNA. Zablokuj igłą rurkę wlotową, która służyła do załadunku kuleczek, korzystając z drugiej rurki wlotowej. Rozpocznij płukanie celi przepływowej roztworem DGAs 1x w żelu blokującym, płucząc intensywnie.

Stukając w platformę, wstrząśnij nią, aby usunąć wszelkie kuleczki nieswoiście przywierające do powierzchni i sprawdzić jej stan. Kuleczki są przywiązane do DNA. Spróbuj zmienić kierunek przepływu.

Po dostatecznym usunięciu wolnych kulek, wyłączyć przepływ i pozwolić komorze osiągnąć stan równowagi. Przygotować świeżą mieszaninę reakcyjną zawierającą białka replikacyjne, zgodnie z instrukcjami w protokole tekstowym. Zamknąć otwartą rurkę wylotową i przełączyć zbiornik wlotowy na świeżo przygotowaną mieszaninę reakcyjną.

Powoli otwórz wylot, aby uniknąć gwałtownych zmian ciśnienia przed przystąpieniem do reakcji enzymatycznej. Najpierw wprowadź roztwór białka do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, aby umożliwić efektywne wiązanie z DNA. Wyłącz przepływ i poczekaj, aż w komorze zostanie osiągnięta równowaga.

Zamknąć rurki wylotowe i wymienić rurkę zawierającą mieszaninę reakcyjną. Za pomocą rurki z buforem płuczącym DGAs wypłukać komorę, aby usunąć wolne białka po płukaniu. Ponownie wyłączyć przepływ i pozwolić komorze osiągnąć stan równowagi.

Zamknij rurki wylotowe i wymień rurkę zawierającą bufor piorący. Użyj rurki z buforem do replikacji T7; bufor do replikacji T7 zawiera chlorek magnezu, który inicjuje reakcję replikacji. Zastosuj przepływ na poziomie 0,012 ml/min, co w warunkach opisanych w niniejszym protokole odpowiada siley ciągu rzędu 3 pN działającej na uwięzi DNA.

Przed obrazowaniem umieść magnes trwały z ziem rzadkich nad celą przepływową, aby zapobiec niespecyficznym oddziaływaniom między koralikami a powierzchnią. Ustaw iluminator światłowodowy pod kątem padania od 10 stopni do ustawienia równoległego względem stolika mikroskopu, w pobliżu pola widzenia mikroskopu z obiektywem 10 x i kamerą CCD. Oświetlenie w ciemnym polu jest stosowane w celu zwiększenia kontrastu w ognisku obrazowania koralików z wykorzystaniem koralika przywiązanego.

Rozpocznij akwizycję danych, rejestrując obraz przez 20 do 30 minut przy niskiej częstotliwości klatek. W udanym eksperymencie można jednocześnie zaobserwować 100 kulek. Eksperyment powinien dostarczyć licznych śladów obrazujących syntezę DNA nici prowadzącej.

Aby zmierzyć szybkość i procesywność rozplatania oraz polimeryzacji DNA, należy wyznaczyć dokładne pozycje kulek. Pozycje te należy dopasować do dwuwymiarowych funkcji Gaussa. Trajektorię należy zwizualizować poprzez śledzenie pozycji kulek w każdej klatce za pomocą oprogramowania do śledzenia.

Następnie, przy użyciu dowolnego oprogramowania graficznego, nanieś pozycję kuleczki w funkcji czasu, aby uzyskać dane dotyczące szybkości. Dopasuj wykresy za pomocą regresji liniowej i oblicz nachylenie dla procesu procesywności. Wyznacz całkowitą długość DNA od początku do końca zdarzenia skracania.

Połącz wszystkie pojedyncze pomiary i nanieś na wykres rozkłady szybkości oraz produktywności, dopasowując dane odpowiednio za pomocą funkcji Gaussa i funkcji pojedynczej wykładniczej. Przedstawiliśmy właśnie sposób pomiaru szybkości i procesywności replikacji DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że siła i pewne naprężenia wywołane przepływem laminarnym nie wpływają na aktywność enzymatyczną białek replikacyjnych.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.