Montaż, napełnianie i centrowanie celi pomiarowej analitycznej ultrawirówki
5 listopada 2009
Komora pomiarowa analitycznej ultrawirówki (AUC) mieści próbkę oraz bufor referencyjny i podczas eksperymentów jest poddawana działaniu wysokiej próżni oraz prędkościom rotacji do 60 000 rpm. Niniejszy film zaprezentuje rygorystyczną dbałość o szczegóły, która jest niezbędna podczas montażu, napełniania i centrowania tego kluczowego elementu eksperymentu AUC.
Witam, nazywam się Andrea Balbo. Pracuję w grupie Petera Shucksa w National Institutes of Health. W tym filmie zaprezentujemy procedury montażu, ładowania i wyrównania rotora celi pomiarowej analitycznej ultrawirówki.
Zacznijmy. Oto elementy celi próbki w analitycznej ultrawirówce. Wewnątrz obudowy celi znajduje się 12 milimetrowy dwusektorowy wkład z eponu i węgla aktywnego, który zostanie umieszczony pomiędzy dwoma zestawami okiennymi. Każdy zestaw okienny składa się z uszczelki okna, wkładki okiennej oraz okna zamocowanego w uchwycie okiennym.
Elementy te należy następnie wsunąć do wnętrza obudowy ogniwa, dopasowując ich wpusty do klinującego wypustu znajdującego się wewnątrz tulei obudowy; następnie należy założyć uszczelkę obudowy i zamknąć ogniwo z próbką za pomocą pierścienia śrubowego, przy zastosowaniu momentu obrotowego od 120 do 140 inch pounds. Po załadowaniu próbki, dwa uszczelki korka obudowy oraz uszczelnienie korka obudowy zamykają otwory załadowcze ogniwa, aby zapobiec powstawaniu artefaktów skanowania, wyciekom i uszkodzeniom podczas eksperymentów. Kluczowe jest, aby wszystkie komponenty były czyste, suche, wolne od kurzu i w jak najlepszym stanie; należy je często sprawdzać i w razie potrzeby wymieniać. Będą również potrzebne następujące elementy: ultrawirówka analityczna, tytanowy rotor czterootworowy, waga laboratoryjna, klucz dynamometryczny z czytelną tarczą i podstawką do klucza, przeciwwaga oraz obciążenia do przeciwwagi, śrubokręt płaski, pęseta, pipeta 200 µL z długą stożkową końcówką, narzędzia do centrowania oraz smar do powlekania wirowego.
Konstrukcję komórki pomiarowej rozpoczynamy od złożenia dwóch zestawów okiennych. Najpierw umieść uszczelkę okienną na dnie uchwytu okna. Następnie ustaw wkładkę okienną, zwaną czasem podkładką okienną, wewnątrz uchwytu okna w taki sposób, aby otwór wkładki znajdował się naprzeciwko wpustu uchwytu pod niewielkim kątem.
Następnie umieść okno w uchwycie, dopasowując znak rylcowy na oknie do wpustu uchwytu okna. Delikatnie dociśnij krawędzie po obu stronach okna. Aby zapewnić odpowiednią szczelność i dokładne osadzenie ogniwa z próbką, lekko smarujemy uszczelkę obudowy w pierścieniu śruby.
Używając smaru do powlekania rotacyjnego, rozprowadź bardzo niewielką ilość środka między kciukiem a palcem wskazującym. Pokryj gwinty pierścienia śruby cienką, niewidoczną warstwą smaru. W ten sam sposób pokryj uszczelkę obudowy.
Wytrzyj cały widoczny smar. Aby rozpocząć montaż celi pomiarowej, wsuń jeden zespół okna oknem skierowanym do góry w stronę użytkownika do obudowy celi, dopasowując wpust do klucza obudowy.
Wyrównaj wpust elementu centralnego z kluczem obudowy i pozwól mu delikatnie opaść na zespół okna wewnątrz obudowy. Nigdy nie używaj żadnych narzędzi do wciskania elementu centralnego do obudowy celi. Może to spowodować trwałe uszkodzenie elementu centralnego, co doprowadzi do nieszczelności podczas przeprowadzanych eksperymentów.
Obróć drugi zespół okienny tak, aby okno było skierowane w stronę elementu centralnego i z dala od Ciebie. Dopasuj wpust do klucza obudowy i nasuń go na element centralny. Na górze umieść uszczelkę obudowy.
Następnie przykręć pierścień śruby tak, aby napis „out” był widoczny, używając do tego palców. Następnie za pomocą narzędzia do wyrównywania dokręć pierścień śruby ręcznie.
Czasami element centralny nie wsuwa się łatwo do tulei obudowy. Można go najpierw wyrównać, a następnie umieścić na nim drugi zespół okienny. Należy przy tym wywrzeć delikatny nacisk w dół na zespół okienny.
Oba elementy można wsunąć do obudowy komórki jednocześnie. W ten sposób unikamy bezpośredniego nacisku na element centralny. Jest to odpowiedni moment, aby sprawdzić, czy wewnątrz komórki nie znajdują się kurz, kłaczki lub odciski palców.
Zauważą Państwo również pierścienie Newtona, które wskazują na obecność powietrza pomiędzy elementem centralnym a okienkami. Znikną one po dokręceniu pierścienia dociskowego, gdy napis „out” będzie widoczny. Wsuńcie kuwetkę z próbką całkowicie do wnętrza komory.
Tulejka zaciskowa stojaka do dokręcania. Przytrzymaj ogniwo w miejscu, wywierając stały nacisk na uchwyt stojaka. Jednym płynnym ruchem dokręć pierścień śruby z momentem od 120 do 140 inch pounds.
Zwolnić uchwyt statywu do dokręcania i ostrożnie wyjąć celę z próbką. Rutynowo ładujemy objętość 400 µL do każdego sektora 12 mm elementu centralnego. Używając pipety 200 µL, ustawić celę z próbką tak, aby otwory do ładowania znajdowały się u góry, a napis „out” na pierścieniu śruby był widoczny.
Wsuń końcówkę pipety do połowy wysokości w lewy sektor elementu centralnego przez otwory do załadunku i powoli nanieś 200 µL roztworu referencyjnego. Powtórz tę czynność raz, aby łącznie nanieść 400 µL, używając tej samej końcówki pipety oraz tej samej techniki, czyniąc to ostrożnie i powoli. Wypełnij prawy sektor elementu centralnego 400 µL roztworu próbki.
Kluczowe jest jak najdokładniejsze dopasowanie objętości roztworów referencyjnych i próbkowych. Mocne osadzenie końcówki na pipecie, powolne pobieranie i dozowanie roztworów, unikanie pęcherzyków powietrza oraz stosowanie tej samej końcówki do obu roztworów pomagają utrzymać równe objętości w celu zamknięcia celi.
Umieść dwie czerwone uszczelki korków obudowy ściśle w każdym otworze załadowczym, upewniając się, że są one starannie rozmieszczone pomiędzy elementem centralnym a aluminiową obudową. Przykryj każdy otwór załadowczy korkiem obudowy i dokręć go ręcznie za pomocą małego śrubokręta płaskiego. Przed załadowaniem rotora upewnij się, że przeciwwaga oraz probówka znajdująca się naprzeciwko niej różnią się wagą nie więcej niż o 0.5 grama.
Zacznij od ustawienia wagi na zero. Najpierw zważ kuwetkę z próbką, która zostanie umieszczona w pozycji przeciwległej do przeciwwagi. Taruj wagę, aby odjąć masę kuwetki z próbką.
Następnie zważ przeciwwagę. W tym przypadku przeciwwaga jest lżejsza od celi z próbką o 4,193 grama. Wybierz odważnik przeciwwagi o masie czterech gramów i wkręć go w otwór mocujący przeciwwagi, upewniając się, że nie wystaje on ponad jej górną krawędź.
Zważ przeciwwagę, aby upewnić się, że końcowa masa mieści się w przedziale 0,5 g. Korzystając z rotora czteroodworowego, umieść przeciwwagę w pozycji czwartej w taki sposób, aby biała strzałka była widoczna i skierowana w stronę siły odśrodkowej. Za pomocą narzędzia do wyrównywania upewnij się, że przeciwwaga została całkowicie osadzona wewnątrz rotora.
Umieść komórkę równoważącą tak, aby zaślepki obudowy były skierowane w stronę środka rotora, a napis „out” na pierścieniu śruby był widoczny. Ponownie, używając narzędzia do wyrównywania, upewnij się, że komórka jest całkowicie osadzona wewnątrz rotora. Patrząc od spodu rotora.
Wyrównaj wnętrze. Za pomocą narzędzia do wyrównywania zaznacz kreską znacznik znajdujący się najbliżej środka rotora względem kreski na przeciwwadze. W ten sam sposób wyrównaj komórkę z próbką w pozycji drugiej.
Po wyrównaniu wszystkich probówek rotor jest gotowy do umieszczenia w komorze wirówki.
Przegląd
W niniejszym filmie zaprezentowano proces montażu, napełniania i wyrównywania ogniwa próbkowego do analitycznej ultrawirówki (AUC), co jest kluczowe dla przebiegu eksperymentów AUC. Podkreślono znaczenie prawidłowej obsługi i przygotowania elementów ogniwa w celu zapewnienia dokładności wyników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analityczna ultrawirowanie
- Metody biofizyczne
- Techniki przygotowania próbek
Wstęp
- Kuweta do AUC jest niezbędna do przeprowadzania eksperymentów przy wysokich prędkościach obrotowych wirnika.
- Składa się ona z wielu komponentów, które muszą zostać precyzyjnie złożone.
- Zachowanie czystości i właściwego ustawienia jest kluczowe, aby uniknąć artefaktów eksperymentalnych.
- Zrozumienie procesu montażu jest niezbędne dla badaczy korzystających z AUC.
Cel badania
- Aby zapewnić szczegółowy przewodnik po montowaniu i ładowaniu próbówki do AUC.
- Aby podkreślić znaczenie starannego przygotowania w eksperymentach AUC.
- Aby umożliwić badaczom dokładne powtórzenie tego procesu.
Zastosowane metody
- Montaż zestawów okiennych i elementu centralnego w celi pomiarowej.
- Przyłożenie momentu obrotowego w celu zabezpieczenia komponentów celi pomiarowej.
- Wprowadzenie roztworów wzorcowych i próbek do celi.
- Wyważenie celi pomiarowej za pomocą przeciwwagi w celu zapewnienia dokładności pomiarów.
Główne wyniki
- Pomyślny montaż komórki próbnej AUC zaprezentowany w filmie.
- Właściwe techniki ładowania zapewniają minimalną liczbę pęcherzyków powietrza i równe objętości.
- Regulacja przeciwwagi jest kluczowa dla dokładnej pracy rotora.
- Wskaźniki wizualne, takie jak pierścienie Newtona, pomagają ocenić jakość montażu.
Wnioski
- Dbałość o szczegóły podczas montażu ogniwa z próbką jest niezbędna dla eksperymentów AUC.
- Przestrzeganie opisanych procedur może zwiększyć wiarygodność eksperymentalną.
- Zaleca się regularną konserwację i kontrolę komponentów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Prawidłowy montaż i wyrównanie cel próbek analitycznej ultracentryfugi są kluczowe dla generowania wiarygodnych danych biofizycznych dotyczących wielkości, kształtu, czystości i stanów oligomeryzacji białek. Skrupulatne przygotowanie celi próbek minimalizuje artefakty eksperymentalne, zapewniając integralność danych niezbędną do walidacji celów i badań mechanistycznych we wczesnej fazie odkrywania leków. Taka rygorystyczność procedury zwiększa pewność prognostyczną w dalszych etapach przesiewowych oraz w procesach optymalizacji liderów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjne określenie stanów oligomeryzacji białek oraz oddziaływań białko-białko, co bezpośrednio dostarcza informacji dla hipotez dotyczących walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezetykietową ocenę właściwości makromolekularnych w roztworze w warunkach zbliżonych do naturalnych.
- Wartość prognostyczna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną podczas redukcji ryzyka związanego z celem terapeutycznym, dostarczając ilościowych współczynników sedymentacji i parametrów kształtu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza danych o rozmiarze i kształcie hydrodynamicznym, które są niezbędne do formułowania buforów do testów oraz badania stabilności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia integralność i monodyspersyjność próbek, co jest kluczowe dla powtarzalności testów biochemicznych i komórkowych.
- Integracja z platformą: Wspiera charakterystykę biofizyczną oczyszczonych celów przed przeprowadzeniem kampanii wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę tworzenia kompleksów białkowych oraz zmian konformacyjnych istotnych dla mechanizmów chorobowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera kontrole spójności między partiami białek rekombinowanych stosowanych w modelach przedklinicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy biofizyczną charakterystykę celu z analizami funkcjonalnymi w układach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przebieg pracy z komorką próbki w analitycznej ultrawirówce wpisuje się w ciąg procesu odkrywania – od walidacji celu po identyfikację wiodących cząsteczek – dostarczając biofizycznych wyników, które pozwalają na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w oparciu o zachowanie i stabilność celu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oligomeryzacji celu i sieci oddziaływań, umożliwiając redukcję ryzyka biologicznego przed opracowaniem testu.
- Przesiewanie: Zapewnia monodyspersyjność i stabilność celu, co bezpośrednio wpływa na gotowość testu i jakość danych w kampaniach przesiewowych.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary współczynnika sedymentacji i masy cząsteczkowej, które pozwalają na porównanie stanów białek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy biofizykę oczyszczonego celu z walidacją funkcjonalną w modelach przedklinicznych dzięki zapewnieniu spójnej jakości materiału.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi ustandaryzowaną, powtarzalną możliwość charakterystyki biofizycznej dla wielu celów i projektów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność co do właściwości celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej oraz zwiększona rygorystyczność walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przygotowania próbek, powtarzalność między uruchomieniami oraz skalowalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Lepiej uzasadnione decyzje go/no-go, zmniejszona częstotliwość niepowodzeń wynikających z niestabilności celu oraz poprawiona efektywność kapitałowa we wczesnej fazie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane z biofizycznej redukcji ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach biofizycznych i precyzyjnego obchodzenia się z komponentami optycznymi.
- Zależne od instrumentarium analitycznej ultrawirówki, kluczy dynamometrycznych, narzędzi do wyrównywania oraz obchodzenia się z próbkami w warunkach czystych (cleanroom).
- Wymaga ujednolicenia protokołów czyszczenia, montażu i aplikacji momentu obrotowego pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania do różnych typów próbek, warunków buforowych i geometrii elementów centralnych.
- Ograniczone przez kruchość komponentów; okna i elementy centralne są podatne na uszkodzenia spowodowane cząstkami stałymi, niewłaściwym momentem obrotowym lub rozregulowaniem.
