Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Fluorescencyjny fałszywy neurotransmiter. FFN 511 to fluorescencyjna monoamina, która po zastosowaniu w skrawkach mózgu może pełnić rolę substratu dla synaptycznego fizycznego transportera monoamin. FN 511 jest pobierany do dopaminergicznych pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem transportera monoamin i może być wykorzystywany do bezpośredniej wizualizacji uwalniania neurotransmiterów z zakończeń presynaptycznych neuronów monoaminergicznych, takich jak neurony w warstwie S. Uwalnianie neurotransmiterów z zakończeń jest widoczne w skrawku jako redukcja punktowych sygnałów fluorescencyjnych.

W tym filmie przygotowano koronalne skrawki mózgu w rozmiarze 250 µm przy użyciu wibrotomu, barwiono je barwnikiem FFN 511 i obrazowano za pomocą wielofotonowego mikroskopu laserowego. Przedstawiono eksperymenty z odblokowaniem, które ujawniają zależną od częstotliwości heterogeniczność uwalniania Ca²⁺. Cześć, jestem HU z laboratorium Davida z Katedry Neurologii na Uniwersytecie Kolumbii.

Cześć, jestem Minerva, również z Soldier Lab. Dzisiaj przedstawimy procedurę znakowania zakończeń dopaminergicznych w skrawkach mózgu z użyciem fluorescencyjnych fałszywych neuroprzekaźników. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania uwalniania dopaminy.

Zacznijmy zatem. Przed przygotowaniem ostrych plastrów jądra półleżącego (sal), należy uprzednio natlenić sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (A CSF) i schładzać go w lodzie przez co najmniej 15 minut przed wyjęciem mózgu; podczas sekcji należy utrzymywać A CSF w niskiej temperaturze i w stanie natlenienia. Wyjmij cały mózg z myszy, a następnie zamocuj go na tacy wibratoma za pomocą kleju kropelkowego. Wyjęcie i zamocowanie mózgu musi zostać wykonane w ciągu dwóch minut.

Wypełnij kuwetę schłodzonym, napowietrzonym A CSF oraz przekrojami koronalnymi mózgu o grubości 250 micrometer, wyciętymi z zakresu od +1.54 do +0.623. Otrzymane zostaną trzy pełne plastry, które można podzielić igłą na sześć połówek. Inkubuj plastry mózgu w napowietrzonym A CSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę.

W natlenionym A CSF przygotować 10 µM roztwór ładujący FFN 511, dodając 10 mM roztwór stokowy FFN 511 do A CSF. Następnie przygotować w A CSF roztwór 100 µM A-D-V-A-S-E-P seven. Oba roztwory należy natleniać przez co najmniej 15 minut przed indywidualnym wprowadzeniem do skrawków. Każdy skrawek mózgu inkubować z roztworem ładującym FFN 511 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie należy usunąć di związane z tkanką pozakomórkową, inkubując załadowany skrawek w natlenionym roztworze advers 100 µM w A CSF przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki są teraz gotowe do obrazowania. Barwienie FFN 511 zostanie zobrazowane w skrawkach przy użyciu multiphotonowego skaningowego mikroskopu laserowego Prairie Ultima. Umieść skrawek załadowany FFN 511 w komorze rejestracyjnej i przepłukuj go natlenionym A CSF z prędkością przepływu od 1 do 2 ml/min. Następnie umieść platynową harfę z nylonowymi strunami na górze skrawka, aby zminimalizować jego ruchy.

Aby dodatkowo zminimalizować ruchy podczas eksperymentu, należy pozostawić skrawki w komorze na co najmniej 10 minut w celu stabilizacji przed obrazowaniem. Przy użyciu obiektywu imersyjnego z wodą 10x, zwizualizuj i zlokalizuj grzbietową część AUM za pomocą luminescencji w jasnym polu, a następnie umieść i ustaw bipolarne, skręcone elektrody wolframowe w tym obszarze w celu przeprowadzenia eksperymentu stymulacyjnego. Obszar obrazowania w stanie spoczynku znajduje się w odległości 300 µm.

Pomiędzy dwoma końcami stymulującej elektrody bipolarnej należy umieścić ten obszar w centrum obrazu pola widzenia FFN 511, z oznakowanymi zakończeniami SAL, przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego 63 x. FFN 511 jest wzbudzany przy 760 nanometrach za pomocą lasera mi tai firmy Spectral Physics. Optymalna fluorescencja zakończeń SAL jest widoczna przez filtr pasmowy; należy rejestrować obrazy w formacie 12-bitowym z obszarami zainteresowania o wymiarach 75 by 75 mikrometrów przy rozdzielczości 512 by 512 pikseli. Przykładowy obraz z zakończeniami dopaminergicznymi SAL oznakowanymi FFN 511 został przedstawiony tutaj.

Znakowanie FFN 511 może zostać usunięte albo przez wysokie stężenia siarczanu amfetaminy z chlorkiem potasu, albo poprzez stymulację elektryczną w eksperymencie usuwania znaczników chlorkiem potasu; gdy do skrawka mózgu aplikowany jest roztwór CSF o wysokim stężeniu potasu, znakowanie FFN 511 zanika w ciągu czterech minut. Należy rejestrować obrazy XYZT, aby śledzić usuwanie FFN 511 w czasie podczas usuwania znakowania FFN 511 za pomocą stymulacji elektrycznej. Przed stymulacją należy uzyskać kontrolną serię obrazów czasowych Zack przez co najmniej pięć minut, aby upewnić się, że ruch skrawka jest minimalny i nie zachodzi fotobleaching wywołany laserem po akwizycji obrazów kontrolnych.

Kontynuuj obrazowanie XYZT, rozpoczynając stymulację z częstotliwościami 1, 4 lub 20 Hz; impulsy są aplikowane lokalnie do prążkowia za pomocą izolatora stymulacji Isoflex wyzwalanego przez generator impulsów Master-8 z wykorzystaniem elektrod bipolarnych. To wideo przedstawia rozkład FFN 511 podczas egzocytozy w skrawku mózgu SAL. Przygotowanie: po zakończeniu ładowania FFN 511 do SAL obserwuje się obfite znakowanie w prążkowiu, rzadkie znakowanie w korze oraz brak znakowania w cielemwołkowym.

Selektywne znakowanie zakończeń dopaminergicznych może zostać zniesione przez wysokie stężenie chlorku potasu, co pokazują te reprezentatywne obrazy przed podaniem chlorku potasu oraz dwie minuty po zastosowaniu 70 mM chlorku potasu. Zniesienie znakowania FFN 511 w płynie mózgowo-rdzeniowym może być również osiągnięte za pomocą amfetaminy. Ten obraz przedstawia znakowanie FFN 511 w prążkowiu przed podaniem amfetaminy.

Podczas gdy ten obraz przedstawia prążkowie 20 minut po odwiązaniu z zastosowaniem 20 µM amfetaminy, odwiązanie znakowania FFN 511 poprzez lokalną stymulację elektryczną zostało zilustrowane na tych obrazach, które pokazują znakowanie FFN 511 w prążkowiu przed stymulacją oraz w 217 sekundzie i 514 sekundzie po rozpoczęciu stymulacji z częstotliwością 4 Hz. Ten wykres znormalizowanej intensywności fluorescencji w czasie pokazuje, że odwiązanie FFN 511 jest zależne od wapnia i częstotliwości; grupy kontrolne reprezentowane przez niez wypełnione trójkąty nie otrzymały stymulacji. Odwiązanie z użyciem chlorku kadmu, reprezentowane przez niez wypełnione koła, było identyczne z kontrolami niestymulowanymi.

Krzywe wygaszania dla każdej częstotliwości stymulacji, reprezentowane przez kolorowe okręgi, dopasowano za pomocą funkcji pojedynczego zaniku wykładniczego, a wartości okresu półtrwania obliczono jako tau pomnożone przez 0.693. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wprowadzić fluorescencyjny czujnik neurotransmitera FFN 5.11 do zakończeń dopaminergicznych w ostrym skrawku i jak wywołać jego uwalnianie za pomocą wysokiego stężenia potasu oraz stymulacji. Jest to pierwsza metoda opracowana w celu optycznego badania uwalniania neurotransmiterów na poziomie pojedynczych zakończeń synaptycznych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu wysokiej żywotności skrawków oraz zwracać uwagę na czas ładowania, tło wybielania i artefakty ruchowe; skrawki wykazują prawidłowe ładowanie FFN five 11 i umożliwiają obrazowanie do czterech godzin po przygotowaniu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.