Test pierścienia aortalnego

Ogólnym celem testu pierścienia aorty (aortic ring assay) jest stworzenie elastycznego systemu eksperymentalnego, w którym naczynia krwionośne wypukają się z całych fragmentów aorty mysiej wewnątrz macierzy 3D. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie aorty piersiowej z myszy, a następnie staranne oczyszczenie jej z pozostałych tkanek otaczających. Przekroje oczyszczonej aorty lub pierścienie aorty umieszcza się w poszczególnych studzienkach płytki 48-dołkowej, z których każda zawiera sformowany w kopuły ekstrakt z macierzy podstawowej (BME).

Dodatkowa kropla BME zamyka pierścień w strukturze 3D. Macierz może zawierać dowolny wybrany odczynnik eksperymentalny. Po inkubacji trwającej kilka dni można zaobserwować wyrastanie naczyń z pierścieni aorty i ocenić potencjał angiogenny badanych związków.

Witam, nazywam się Karen Bein i pracuję w laboratorium dr. E. Lewisa w Departamencie Biochemii Klinicznej na Uniwersytecie Beon w Be Sheva w Izraelu. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę testu pierścienia aorty mysiej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wpływu różnych substancji na tworzenie naczyń krwionośnych.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozwolić ekstraktowi z błony podstawnej (BME) na rozmrożenie na lodzie lub w temperaturze 4°C. Po rozmrożeniu należy nadal przechowywać BME w niskiej temperaturze, aby zapobiec jego ponownemu zastygnięciu.

W dniu eksperymentu uśmierć mysz w wieku od sześciu do siedmiu tygodni poprzez standardowy zastrzyk z ketaminy i ksylazyny, wykonaj szybkie upuszczenie krwi z tętnic szyjnych, a następnie dokonaj dyslokacji szyjnej. Rozpocznij procedurę, przecierając zwierzę 70% etanolem w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj sterylnej pęsety i nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pionowe nacięcie skóry i otworzyć ścianę otrzewną.

Należy wykonać nacięcie w celu odsłonięcia górnej części mostka, gdzie przecina się również klatkę piersiową i usuwa przeponę. Następnie należy ostrożnie odsunąć wszystkie organy, całkowicie odsłaniając aortę piersiową położoną wzdłuż kręgosłupa. Po odsłonięciu aorty należy wprowadzić cienką sterylną pęsetę między aortę a kręgosłup. Rozwierając pęsetę, należy stopniowo unieść aortę z jej łoża, oddzielając odcinek piersiowy od pozostałej części aorty.

Po oddzieleniu aorty, użyj ostrych nożyczek, aby wyciąć ją z organizmu myszy, zaczynając od końca znajdującego się w bliskim sąsiedztwie naczyń nerkowych i kończąc w pobliżu serca. Umieść wyciętą aortę piersiową w płytce Petriego wypełnionej zimnym, sterylnym PBS. Po usunięciu aorty można przygotować pierścienie aortalne, używając dwóch sterylnych pęset i pracując pod stereomikroskopem.

Oczyść aortę piersiową z otaczającej tkanki tłuszczowej. Należy uważać, aby nie uszkodzić aorty i trzymać ją wyłącznie za krawędzie. Aortę należy wielokrotnie zanurzać w szalce Petriego zawierającej PBS, aby zapobiec odwodnieniu do czasu całkowitego oczyszczenia.

Po oczyszczeniu aorty piersiowej należy użyć skalpela i, pracując pod stereomikroskopem, równomiernie pociąć aortę na pierścienie o grubości 1 mm. Wykorzystując jako prowadnicę linijkę umieszczoną pod powierzchnią tnącą, należy pamiętać o stosowaniu nowego ostrza i jego okresowej wymianie w celu zachowania ostrości. Końce aorty nie są wykorzystywane. Po wycięciu każdego pierścienia należy bardzo delikatnie przenieść go pęsetą do nowej płytki zawierającej zimny PBS.

Umieść wszystkie pierścienie w tej samej płytce zawierającej PBS, aby zapewnić randomizację testu. Ponieważ każdy segment aorty ma nieco inny potencjał angiogenny, przechowuj pierścienie na lodzie. Następnie przygotuj płytkę testową, używając wcześniej schłodzonych końcówek do pipet.

Do każdego dołka płytki 48-dołkowej dodaj kroplę około 150 µL schłodzonego BME; kropla utwardza się, tworząc kopułę w trakcie procesu. BME umożliwia transport substancji, chemotaksję komórek, a przede wszystkim różnicowanie i migrację komórek prowadzącą do powstawania nowych naczyń. Dołków obwodowych należy wypełnić PBS, aby zapobiec odwadnianiu BME. Pozostaw kroplę BME do utwardzenia w temperaturze 37 °C przez 20 do 30 minut. Po utwardzeniu BME ostrożnie wyjmij pierścień aorty z naczyń Petriego za pomocą pęsety. Aby zapobiec uszkodzeniom, pierścień należy przenieść wewnątrz kropli lipidu tworzącej się między końcówkami pęsety. Dzięki napięciu powierzchniowemu cieczy umieść pojedynczy pierścień aorty w górnej części centrum każdej kopuły i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Na każdy pierścień dodaj kolejne 150 µL BME i inkubuj przez 20 do 30 minut.

W temperaturze 37°C pierścień zostaje teraz zatopiony w BME oraz roztworze analitycznym. Do płytki można dodać materiały w celu rozpoczęcia analizy. Uzupełnij wcześniej przygotowane bezserumowe medium dla ludzkich komórek śródbłonka albo materiałem eksperymentalnym, albo suplementem wzrostu komórek śródbłonka jako kontrolą pozytywną lub negatywną.

Użyć samego podłoża. Do każdej studniki dodać 500 µL podłoża z suplementem pres i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 do 12 dni. W czasie inkubacji badać płytkę pod mikroskopem, poszukując naczyń wyrastających z aorty oraz zaawansowanych, dojrzałych naczyń, które można zidentyfikować po dalszym rozgałęzieniu.

Należy przeprowadzić trójwymiarową dokumentację fotograficzną pierścieni tkanki pierścieniowej w okresie od szóstego do dwunastego dnia, korzystając ze standardowego stereomikroskopu z kontrastem fazowym. Dodatkowo należy pobierać nadsączone w różne dni między szóstym a dwunastym dniem; próbki przeznaczone do użycia w ciągu jednego dnia należy przechowywać w temperaturze 4°C, natomiast próbki do późniejszego wykorzystania należy przechowywać w temperaturze -20°C lub -80°C. Nadsączone można analizować za pomocą różnych technik, takich jak test ELISA w celu oznaczenia vgf lub test GREASE do pomiaru poziomu tlenku azotu.

Obrazy te zostały wykonane 12 dni po umieszczeniu pierścieni w studzienkach i inkubacji z hodowlą (medium widoczne w górnym rzędzie obrazów) lub ECGS, użytym jako kontrola pozytywna dla kiełkowania naczyń widocznego w dolnym panelu. Każdy obraz stanowi reprezentatywny kadr z czterech z 12 pierścieni, które są zazwyczaj stosowane w tym teście dla każdego stanu doświadczalnego.

Narożnik każdego pierścienia aorty w każdej oddzielnej studni jest czarny. Przy takim sposobie fotografowania pierścienie aorty poddane działaniu ECGS wykazują wzrost naczyń, a strzałki wskazują kilka z wielu powstałych naczyń. Każde naczynie charakteryzuje się strukturą łańcuchów komórek śródbłonka z rzadkimi rozgałęzieniami, co wskazuje na ich dojrzałość.

W hodowli nie obserwuje się żadnych kiełkujących naczyń. Dołki z pożywką w górnym panelu. Właśnie zaprezentowaliśmy, jak przeprowadzić test aortowy podczas realizacji tej procedury. Ważne jest, aby pracować precyzyjnie i przestrzegać określonych warunków.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.