Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowych konstrukcji tkankowych z zagregowanych komórek i macierzy pochodzenia komórkowego, które mogą być wykorzystane do analiz funkcjonalnych. Jest to osiągane poprzez najpierw wyfrezowanie formy z poliwęglanu w celu utworzenia pierścieniowych studni o zaokrąglonym dnie. Następnie na formie z poliwęglanu odlewa się polidimetylosiloksan (PDMS), aby stworzyć szablon.

Następnie matryca PDMS służy do formowania studniek aros. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek do studniek aros, aby umożliwić im agregację i utworzenie spójnych pierścieni tkankowych. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do osiągnięcia samoorganizacji komórkowej oraz inżynierii tkankowej z wykorzystaniem różnych typów komórek, a także umożliwia analizę wkładu komórek i pochodzonej od nich macierzy pozakomórkowej w strukturę i funkcję tkanki.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi podejściami w inżynierii tkankowej jest możliwość generowania konstruktów tkankowych w całości z komórek i produkowanej przez nie macierzy zewnątrzkomórkowej w czasie krótszym niż zgłaszano wcześniej, oraz w formacie sprzyjającym analizie mechanicznej. Rozpocznij od wyfrezowania kawałka poliwęglanu o grubości pół cala w celu utworzenia 15 okrągłych studni pierścieniowych z centralnym trzpieniem o średnicy 2 mm. Oczyść formę poliwęglanową, aby usunąć wszelkie odpryski tworzywa powstałe podczas procesu frezowania, i pozostaw ją do wyschnięcia. Następnie wymieszaj PDMS w stosunku bazy do utwardzacza 10:1. Odpowietrz roztwór, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie wlej go do formy poliwęglanowej.

Następnie ponownie odgazuj mieszaninę na formie, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza, i utwardzaj PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez cztery godziny; w czasie utwardzania PDMS rozpuść 2% AROS w DMEM. Po utwardzeniu ostrożnie usuń szablon PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, następnie umyj PDMS wodą z mydłem i wysterylizuj w autoklawie wraz z roztworem DMEM AROS. Teraz umieść wysterylizowany szablon PDMS na płaskiej powierzchni i wypełnij go stopionym AROS, wprowadzając go najpierw pipetą do każdej z form na środkowe słupki, a następnie pipetą do przestrzeni wokół nich.

Pozostaw arosy do utwardzenia przez około 15 minut. Następnie odwróć formę, aby oddzielić arosy od PDMS. Odetnij nadmiar arosów z okolic każdej z studni, a następnie umieść jedną studnię aros w każdej studni płytki 12-dołkowej.

Dodaj pożywkę do hodowli komórkowej wokół zewnętrznej części studni aros, nie zakrywając jej górnej części. Następnie umieść płytki w inkubatorze, aby mogły się ustabilizować w czasie przygotowywania komórek. Przy 90% konfluencji poddaj szczury mięśni gładkich aorty trypsynizacji i resuspenduj.

Zawiesić komórki w stężeniu 5 × 10⁶ komórek na ml. Następnie pipetą przenieść 100 µl resuspendTime zawiesiny komórkowej do każdej z równoważących się studzienek aros. Komórki nanosić do studninek wykonując ruchy okrężne.

Umieść płytki w inkubatorze na 24 godziny, nie zakłócając ich stanu. Wymieniaj pożywkę co dwa dni, odsysając ją z okolic studni, a następnie ponownie napełniając każdą studnię, aż forma aros zostanie całkowicie zanurzona. Po zakończeniu hodowli napełnij małą szalkę Petriego roztworem PBS.

Wyjmij każdy pierścień z formy aros, przesuwając go przez górną część centralnego wspornika. Umieść pierścienie w szalkach Petriego z PBS Center, a jeden z pierścieni pod cyfrowym systemem obrazowania. Użyj oprogramowania do detekcji krawędzi, aby zmierzyć grubość pierścienia w czterech pozycjach: górnej, dolnej, lewej i prawej części jego obwodu.

W celu przeprowadzenia jednoosiowej próby rozciągania zamocuj próbkę w kształcie pierścienia w dwóch uchwytach z cienkiego drutu. Rozsuwaj uchwyty, aż do momentu przyłożenia do pierścienia obciążenia rozdzierającego równego 5 mN.

Następnie wprowadź pole przekroju poprzecznego obliczone na podstawie pomiarów grubości i zapisz długość rozciągania. Poddaj pierścień ośmiokrotnemu cyklowaniu pomiędzy obciążeniem rozdzierającym a 50 kPa. Przyłóż naprężenie z prędkością 10 mm/min; po ósmym cyklu wstępnym rozciągnij próbkę do zerwania z prędkością 10 mm/min.

Dla każdego pierścienia zmierz maksymalne naprężenie rozciągające oraz odkształcenie krytyczne, a następnie na podstawie uzyskanych danych oblicz maksymalny moduł styczności. Oprócz funkcjonalnych badań in vitro, te pierścienie z żywych komórek mogą również łączyć się, tworząc tkankowe rurki. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby ściąć końce rurek silikonowych pod kątem w celu utworzenia skosowanych krawędzi, a następnie poddaj rurki silikonowe autoklawowaniu.

Napełnij szalkę Petriego pożywką, przenieś wysterylizowane uchwyty z niestandardowych rurek silikonowych do komory z laminarnym przepływem powietrza i umieść je w pustej szalce Petriego. Następnie wyjmij pierścienie z dołków aros i umieść je w szalce Petriego wypełnionej pożywką. Umieść rurki silikonowe w tej samej szalce Petriego, aby je nawilżyć przed użyciem.

Za pomocą pęsety umieść końcówkę rurki silikonowej w centrum pierścienia i delikatnie nasuń pierścień na rurkę silikonową. Przesuń pierścienie tak, aby stykały się ze sobą, delikatnie popychając je sukcesywnie w obu kierunkach wzdłuż rurki. Po zamontowaniu pierścieni ustaw rurki silikonowe w uchwytach z poliwęglanu i skręć obie części uchwytu.

Do szalki Petriego dodaj 55 mililitrów pożywki. Wymieniaj pożywkę co trzy dni przez cały okres hodowli w celu usunięcia probówek z tkankami. Najpierw napełnij szalkę Petriego roztworem PBS.

Następnie zwolnij rurki silikonowe z uchwytu poliwęglanowego i za pomocą pęsety zsuń rurki tkankowe z rurek silikonowych do naczynia. Przy prawidłowym wykonaniu komórki osiadają na dnie studni aros i kurczą się w ciągu 24 godzin od osadzenia, tworząc pierścień tkanki wokół centralnego słupka w studni Agarro; przedstawiony wykres jest reprezentatywną krzywą naprężenie-odkształcenie otrzymaną z jednowymiarowej próby rozciągania dwumilimetrowego pierścienia tkankowego wytworzonego z komórek mięśni gładkich szczura. Wartości wytrzymałości doraźnej na rozciąganie, maksymalnego modułu sprężystości oraz odkształcenia krytycznego są następnie wykorzystywane do porównania właściwości mechanicznych próbek pierścieni tkankowych hodowanych przy różnych parametrach kultury.

Właściwości mechaniczne pierścieni tkankowych można kontrolować poprzez zmianę parametrów hodowli, w tym liczby wysianych komórek, czasu trwania hodowli, pożywki hodowlanej oraz zastosowanego typu komórek. Oprócz szczurzych komórek mięśni gładkich, ludzkie pierwotne komórki mięśni gładkich tworzą pierścienie tkankowe o podobnej wytrzymałości na rozciąganie.

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste również agregują, tworząc pierścienie, jednak nie były one wystarczająco wytrzymałe do przeprowadzenia testów mechanicznych. Nasz system umożliwia wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkankowych w całości z komórek poprzez proste wysiewanie ich do naszych dedykowanych studzienek aros. Po obrobieniu początkowej formy z poliwęglanu możemy wykonać nieograniczoną liczbę szablonów z PDMS, które następnie służą do tworzenia form, dzięki czemu nie jest wymagany żaden dodatkowy sprzęt.

System ten jest wszechstronny, ponieważ wykorzystaliśmy w nim szereg różnych typów komórek do tworzenia pierścieni tkankowych; w związku z tym może on potencjalnie służyć zarówno w zastosowaniach z zakresu inżynierii tkankowej, jak i w badaniach in vitro nad wkładem komórek oraz macierzy zewnątrzkomórkowej w strukturę i funkcję tkanek.